导读:本文包含了大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大肠杆菌,克隆表达,苹果酸脱氢酶,纯化
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因论文文献综述
李倩,徐美娟,夏海锋,饶志明[1]（2011）在《大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质》一文中研究指出以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙叁醇可显着提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2011年02期）
李倩[2]（2010）在《大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh克隆、高效表达及酶学性质研究》一文中研究指出苹果酸脱氢酶(MDH)是叁羧酸循环中的一个关键酶,在生物体内普遍存在,MDH以NADH或NAD+为辅因子,催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的相互转化。本课题以大肠杆菌基因组为模板,分子克隆了939 bp的mdh基因,并与表达载体pET-28a (+)连接,转化大肠杆菌BL21,得到重组菌pET-28a-mdh/BL21。IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a (+)上的6His·Tag标记选用Ni2+柱纯化具有酶活性的MDH,表达后的粗酶液比酶活是43 U/mg,纯化后的比酶活是112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0-6.0的酸性范围内稳定,反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Ni2+、CO2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙叁醇可显着提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L, Vmax为0.47μmol/L.min。本实验还将苹果酸脱氢酶基因连接到分泌表达载体pET-22b(+)上,再将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了苹果酸脱氢酶的胞外表达,采用细胞裂解缓冲液一步提取法快速地在大肠杆菌的周质中获得了目的蛋白,并测得该蛋白比酶活为48.2 U/mg。为了提高MDH的热稳定性,本实验以重组质粒pET-28a-mdh为模板,采用基因定点突变技术在苹果酸脱氢酶基因中引入叁个点突变(L225K、D45E、Q229E)。将突变基因与表达载体pET-28a(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a(+)上的His6·Tag标记选用Ni2+柱纯化苹果酸脱氢酶,在不同的温度(35℃、45℃、55℃、65℃)下保温一小时,测定不同温度下的比酶活,以未经点突变的苹果酸脱氢酶为对照,发现在Q229E处对苹果酸脱氢酶基因进行定点突变后的MDH热稳定性较好。45℃保温一小时后的相对酶活仍有73%,65℃相对酶活为44%。而在L225K和D45E处定点突变后表达的MDH,在45℃相对酶活分别为56.5%和38.6%,到65℃时的酶活损失较大,分别为28.6%和9%；未经定点突变的MDH在45℃相对酶活为45.6%,65℃的相对酶活为3.7%。说明在L225K和D45E处对MDH的定点改造没有明显提高苹果酸脱氢酶的热稳定性。对苹果酸脱氢酶的最适温度进行研究发现：未经点突变的苹果酸脱氢酶和L225K、D45E、Q229E叁处点突变后的苹果酸脱氢酶最适反应温度没有变化,仍在37℃左右,相对酶活未受影响。(本文来源于《江南大学》期刊2010-11-01）
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
苹果酸脱氢酶(MDH)是叁羧酸循环中的一个关键酶,在生物体内普遍存在,MDH以NADH或NAD+为辅因子,催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的相互转化。本课题以大肠杆菌基因组为模板,分子克隆了939 bp的mdh基因,并与表达载体pET-28a (+)连接,转化大肠杆菌BL21,得到重组菌pET-28a-mdh/BL21。IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a (+)上的6His·Tag标记选用Ni2+柱纯化具有酶活性的MDH,表达后的粗酶液比酶活是43 U/mg,纯化后的比酶活是112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0-6.0的酸性范围内稳定,反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Ni2+、CO2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙叁醇可显着提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L, Vmax为0.47μmol/L.min。本实验还将苹果酸脱氢酶基因连接到分泌表达载体pET-22b(+)上,再将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了苹果酸脱氢酶的胞外表达,采用细胞裂解缓冲液一步提取法快速地在大肠杆菌的周质中获得了目的蛋白,并测得该蛋白比酶活为48.2 U/mg。为了提高MDH的热稳定性,本实验以重组质粒pET-28a-mdh为模板,采用基因定点突变技术在苹果酸脱氢酶基因中引入叁个点突变(L225K、D45E、Q229E)。将突变基因与表达载体pET-28a(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a(+)上的His6·Tag标记选用Ni2+柱纯化苹果酸脱氢酶,在不同的温度(35℃、45℃、55℃、65℃)下保温一小时,测定不同温度下的比酶活,以未经点突变的苹果酸脱氢酶为对照,发现在Q229E处对苹果酸脱氢酶基因进行定点突变后的MDH热稳定性较好。45℃保温一小时后的相对酶活仍有73%,65℃相对酶活为44%。而在L225K和D45E处定点突变后表达的MDH,在45℃相对酶活分别为56.5%和38.6%,到65℃时的酶活损失较大,分别为28.6%和9%；未经定点突变的MDH在45℃相对酶活为45.6%,65℃的相对酶活为3.7%。说明在L225K和D45E处对MDH的定点改造没有明显提高苹果酸脱氢酶的热稳定性。对苹果酸脱氢酶的最适温度进行研究发现：未经点突变的苹果酸脱氢酶和L225K、D45E、Q229E叁处点突变后的苹果酸脱氢酶最适反应温度没有变化,仍在37℃左右,相对酶活未受影响。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因论文参考文献
[1].李倩,徐美娟,夏海锋,饶志明.大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质[J].食品与生物技术学报.2011
[2].李倩.大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh克隆、高效表达及酶学性质研究[D].江南大学.2010