一、Fas和Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义（论文文献综述）
韩健松[1]（2021）在《Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究》文中提出研究背景在我国,尿路上皮癌（UC）仍是目前最常见的泌尿系统恶性肿瘤。然而,迄今为止,与细胞毒性疗法相比,尚无针对UC靶向药物的临床试验证明可以提高存活率。癌症基因组图谱（TCGA）已在膀胱癌中检测到许多潜在发挥重要作用的基因改变,为在这种疾病中使用小分子抑制剂提供了路线图。此外,在过去的五年中,随着飞速发展的新一代测序技术,深度测序实时定义着肿瘤的分子特征。寻找膀胱癌治疗诊断特异性的靶向基因,成为精准治疗时代亟需解决的问题。研究目的结合体内外实验,在验证Pokemon在膀胱癌中表达情况的基础上阐明其与膀胱癌体内外的肿瘤恶性行为有关。应用“挽救实验”明确Pokemon可以调控靶基因IGFBP3,同时进一步阐明IGFBP3抑制膀胱癌肿瘤恶性生物学功能。应用高通量芯片分析及利用亚硫酸氢盐修饰后基因组测序,揭示Pokemon通过影响IGFBP3表观遗传修饰发挥抑制膀胱癌转移的分子机制,并积极寻找IGFBP3调控的下游通路。进而对积极寻找靶向治疗膀胱癌的新方法提供理论依据和临床数据支撑。研究方法1.确定Pokemon在膀胱癌中高表达以及发挥促癌作用。（1）应用免疫组织化学染色检测临床组织样本中Pokemon的表达情况。（2）应用western blot,荧光定量PCR实验检测膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞中Pokemon mRNA和蛋白表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低Pokemon细胞。（4）分别做细胞-细胞粘附实验,细胞基质粘附实验,Transwell小室侵袭迁移实验,失巢凋亡实验。分析Pokemon在这些肿瘤转移表型中的作用。最后,通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因,Integrin-β1,MMP-9,BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。2.确定IGFBP3在膀胱癌中的表达情况以及发挥抑癌作用。（1）对从临床组织标本进行免疫组织化学染色检测组织中IGFBP3的表达情况。（2）对膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞进行western blot,实时荧光定量PCR实验检测IGFBP3在细胞中表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低IGFBP3细胞。（4）分析IGFBP3在上述肿瘤转移表型中的作用。通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因的mRNA和蛋白表达水平。3.证明Pokemon是通过靶向调控IGFBP3影响膀胱癌的转移。设计挽救实验,同时敲低Pokemon和IGFBP3,判断相比于单独敲低Pokemon时肿瘤转移表型以及相关功能蛋白表达有无回复,判断Pokemon是否通过靶向作用IGFBP3影响肿瘤转移。4.验证Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制,寻找IGFBP3下游信号通路。（1）在膀胱癌细胞中转染siPokemon和FAM无义序列,进行亚硫酸氢盐修饰后基因组测序。根据测序结果,分析IGFBP3的启动子区域发生甲基化的具体CpG位点,绘制甲基化图谱。分析阴性对照组和敲除Pokemon组的IGFBP3启动子甲基化程度高低。（2）在膀胱癌细胞中转染pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1IGFBP3,培养24h后,收集细胞,进行转录组测序。通过统计学分析列出所有在过表达IGFBP3后有统计学差异的上调/下调基因,绘制热图。并通过分析,筛选膀胱癌转移相关的信号通路。确定信号通路后,通过实时荧光定量PCR和western blot,对该信号通路进行验证。5.动物模型的建立进行体内实验。将稳定敲除/过表达Pokemon和IGFBP3的T24细胞进行裸鼠尾静脉注射,建立裸鼠膀胱癌尾静脉转移模型,8周后处死小鼠,开腹检查膀胱肿瘤转移情况,肉眼计数肺部转移灶的数目。并对组织切片做HE染色判断肿瘤转移情况。研究结果1.Pokemon在膀胱癌组织和旁组织中的高表达率有显着差异,癌组织高表达率67.3%,癌旁组织高表达率26.9%;膀胱癌细胞系中Pokemon的mRNA和蛋白表达量都高于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,Pokemon表达高低与膀胱癌的肿瘤分期以及是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小的相关性没有统计学意义。2.Pokemon可以促进膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;Pokemon可以抑制细胞-细胞粘附和失巢凋亡;Pokemon可以促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。3.IGFBP3在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的低表达率有显着差异,癌组织低表达率63.5%,癌旁组织低表达率38.5%;膀胱癌细胞系中IGFBP3的mRNA和蛋白表达量都低于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,IGFBP3表达高低与膀胱癌是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小,肿瘤分期的相关性没有统计学意义。4.IGFBP3可以抑制膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;IGFBP3可以促进细胞-细胞粘附和失巢凋亡;IGFBP3可以抑制MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达;IGFBP3可以抑制VASP和Paxillin的共定位表达,这代表了IGFBP3对黏着斑形成的抑制作用。5.Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达,促进膀胱癌的侵袭迁移,细胞-基质黏附。抑制膀胱癌的细胞-细胞粘附,抑制膀胱癌细胞失巢凋亡。Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。6.T24细胞中敲低Pokemon的siPokemon组与阴性对照组相比,16个位点的甲基化比例下降,2个位点甲基化比例上升。J82细胞的siPokemon组与阴性对照组相比10个位点的甲基化比例下降,3个位点的甲基化比例上升。38个位点总的甲基化位点占比显示与对照组相比,siPokemon组的T24和J82细胞中IGFBP3启动子甲基化位点百分比降低,证明当Pokemon表达减少时,会使IGFBP3启动子去甲基化从而恢复IGFBP3的转录表达。7.真核有参转录组测序发现IGFBP3的过表达可以引起RIG-1的表达量增高,p<0.05。对信号通路的验证实验结果表明:敲低Pokemon或过表达IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均升高,而过表达Pokemon或敲低IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均降低。“挽救”实验结果表明,共转染siPokemon和si IGFBP3时,RIG-1的转录表达水平相比于单独敲低Pokemon时显着降低。8.在体内动物模型实验中,阴性对照组小鼠肺部发现大量转移性肿瘤结节。而敲低Pokemon的小鼠和过表达IGFBP3的小鼠和对照组相比,小鼠肺部转移性结节数量明显减少,尺寸明显变小,HE染色结果表现与大体组织表现一致。证明了敲低Pokemon和过表达IGFBP3组裸鼠表现出相似的转移抑制特性。结论Pokemon可以通过促进IGFBP3启动子甲基化抑制IGFBP3的转录表达,进而促进膀胱癌的转移。而且膀胱癌中Pokemon-IGFBP3可以调控下游RIG-1信号通路。
贾文玉[2]（2021）在《基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用》文中提出目的:在临床样本中探讨膀胱癌肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞与肿瘤分期及恶性程度的关系,通过动物实验及细胞实验探究均一猪苓多糖（HPP）调节肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞从而发挥抗膀胱癌作用,在巨噬细胞亚型分析的基础上进一步明确猪苓均一多糖活化巨噬细胞抗肿瘤的免疫分子机制。方法:第一节:膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润与膀胱癌恶性程度的关系研究收集29例确诊为尿路上皮癌患者的基本临床资料（年龄、性别、临床诊断、病理分级）和膀胱病理组织切片,进行免疫组化染色,检测膀胱组织中M2亚型巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67的表达,分析M2亚型巨噬细胞的浸润程度与膀胱癌的分级、肿瘤细胞恶性程度的关系。第二节:均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响收集课题组前期采用BBN膀胱癌模型大鼠进行HPP药效研究的膀胱癌组织石蜡块,取空白组、模型组、HPP处理组及卡介苗处理组,将石蜡组织切片后进行免疫组化染色,检测膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206、CD16、CD86及细胞增殖指标Ki-67的表达情况,探讨HPP干预的膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞亚型的变化情况。第三节:均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究将人急性单核细胞白血病细胞THP-1用不同浓度（0,10,20,50,100,200 ng/mL）的佛波酯诱导为巨噬细胞,通过细胞形态、细胞黏附能力的变化及细胞膜表面分子CD14、CD68的表达情况判断出最佳的诱导浓度作为后续实验中的巨噬细胞模型。提取的均一猪苓多糖（HPP）对THP-1来源的巨噬细胞进行干预,采用RT-PCR法研究HPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及INOS mRNA表达情况的影响,流式细胞术检测巨噬细胞膜表面分子CD86、CD16、CD40和CD23的表达,ELISA法检测细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。HPP干预THP-1来源的巨噬细胞72 H后,更换新鲜培养基,继续培养24H,收集活化的巨噬细胞上清,按照巨噬细胞上清:新鲜培养基1:1的比例处理人膀胱癌细胞系T24及EJ,采用MTT法检测肿瘤细胞24 H和48 H的细胞活力变化,EDU增殖实验检测膀胱癌细胞48 H的增殖情况变化,克隆形成实验检测癌细胞增殖能力和成球能力,流式细胞术检测48 H的细胞周期和细胞凋亡的变化情况。Transwell实验检测细胞迁移能力的改变,Western Blot检测凋亡蛋白、上皮间质转化（EMT）相关蛋白以及通路分子JAK2-STAT5/NF-κB蛋白的表达。JAK2抑制剂AZD1480给予膀胱癌细胞系T24及EJ处理后,检测P-JAK2的表达情况及膀胱癌细胞细胞活力、细胞凋亡的变化情况。第四节:基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨用THP-1来源的巨噬细胞作为研究对象,给予均一猪苓多糖10 μ g/mL、T24肿瘤细胞上清:新鲜培养基1:1进行处理,培养72 H后收集细胞检测细胞膜表面分子CD209、CD301、CD172 α、CD36、CD163、CD16、CD23 及 CD206 的表达情况。细胞因子的检测是在刺激剂活化巨噬细胞72 H后更换新鲜培养基继续培养24 H,收集细胞上清,采用液相悬浮芯片技术检测 TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL24、CCL22、CXCL9、CCL17、IL-23p40的含量,采用ELISA法检测TGF-β的表达情况。整理数据,根据上述细胞因子及细胞膜分子的表达情况,分析HPP活化巨噬细胞的抗肿瘤作用及肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进展的机制。结果:第一节:患者的基础资料（年龄、性别）与膀胱癌的浸润程度以及病理分级之间无明显相关性（P>0.05）;M2亚型巨噬细胞表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67在浸润性膀胱癌中的表达均高于非浸润性膀胱癌（P<0.05）,在高级别膀胱癌中的表达均高于低级别膀胱癌（P<0.05）。CD163、CD206在膀胱癌组织中的浸润程度均与Ki-67的表达呈正相关（rs>0）,与CD206相比较,CD163和Ki-67表现出了更强的相关性（P<0.001）。第二节:与空白组大鼠相比较,BBN膀胱癌模型大鼠肿瘤组织内CD163和CD206的表达明显升高（P<0.05）,CD16和CD86显示出升高的趋势,但无统计学意义。与模型组相比较,BCG组和HPP组的CD163和CD206的表达量均呈现下降趋势,但只在CD163表现出显着性（P<0.05）,CD86和CD16的表达量均表现出来升高的趋势,但未表现出来明显的统计学意义（P>0.05）。模型组BBN膀胱癌大鼠的肿瘤组织中Ki-67的表达量明显高于正常大鼠（P<0.05）,与模型组相比较,BCG和HPP干预后肿瘤组织中Ki-67明显减少（P<0.05）。第三节:HPP在0-100 μg/mL浓度范围内对人单核细胞系THP-1未表现出细胞毒性（P>0.05）;50 ng/mL PMA是THP-1诱导为巨噬细胞的最佳浓度;HPP能诱导THP-1来源的巨噬细胞IL-1 β、IL-6、INOS、TNF-α mRNA的表达升高（P<0.05）、上调细胞表面分子CD86、CD23、CD40、CD16（P<0.05）。HPP活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,并伴有时间依赖性（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的克隆形成能力,阻断细胞周期进程,使得细胞周期停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞向S期过度,从而抑制肿瘤增殖（P<0.05）;促进人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞凋亡,主要表现为促进晚期凋亡,细胞凋亡时伴有细胞体积的皱缩,并伴有凋亡抑制蛋白Bcl-2水平下降（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞迁移能力,抑制肿瘤细胞的上皮间质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin,上调E-cadherin的表达。HPP活化的巨噬细胞能够下调人膀胱癌细胞系EJ、T24细胞中通路分子 JAK2-STAT5/NF-κB 的表达（P<0.05）;JAK2 抑制剂 AZD1480 能够抑制 JAK2磷酸化蛋白P-JAK2的表达（P<0.05）、抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,促进细胞凋亡（P<0.05）。第四节:HPP上调细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-23 P40、IL-10及细胞膜受体CD16、CD86、CD23、CD40、CD36 的表达,下调了 CCL2、CCL24 及 CD209、CD301、SIRPα 的表达,对于 TGF-β、IL-6、CCL22、CCL17、CCL18、CXCL9、CD163、CD206 无明显影响;肿瘤细胞上清能够上调巨噬细胞中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL22、CCL24 及细胞膜表面受体 SIRP α、CD36、CD16、CD86、CD209、CD163、CD23 的表达,下调 TNF-α 表达,对于 IL-23、CXCL9、CCL17、CD40、CD206、CD301的表达无明显影响。结论:1、膀胱癌患者肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的浸润程度与肿瘤的肌层浸润程度、病理分级及恶性程度有关。2、HPP能够下调膀胱癌大鼠肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的表达,上调M1亚型巨噬细胞的表达,促进肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞向M1亚型极化,并抑制肿瘤细胞的增殖。3、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24、EJ的细胞活力及增殖能力,阻断细胞周期,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移能力及上皮间质转化,HPP活化的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用是通过JAK2-STAT5/NF-κB通路实现的。4、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子杀伤肿瘤细胞,并通过减轻肿瘤微环境中的免疫抑制来发挥抗膀胱癌作用;肿瘤细胞通过诱导TAMs分泌炎症抑制因子及免疫抑制分子诱导免疫系统的失活,从而促进肿瘤的进展。
毕然[3]（2021）在《上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞》文中提出研究背景:肾透明细胞癌（RCC）发病率高,严重地威胁人类的生命健康。对于晚期和转移的肾癌患者,安全有效的治疗方法仍然需要进一步研究。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可以高度选择性地诱导癌细胞凋亡,对正常组织的毒害性很小,因此可以作为安全的抗癌药物。但是在越来越多的研究中发现,癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡具有明显的抗性。死亡受体是TRAIL诱导癌细胞凋亡的靶点,死亡受体的蛋白表达水平被认为和TRAIL的敏感性正相关。提高肾癌细胞的死亡受体表达水平可以恢复肾癌细胞对TRAIL的敏感性。目的:（1）证明上调死亡受体的蛋白表达水平可以恢复肾癌对TRAIL的敏感性;（2）寻找安全有效的TRAIL的增敏剂,为TRAIL的临床应用提供可能;（3）深入探索穿心莲内酯和PFT-β与TRAIL联合应用抑制肾癌细胞增殖和迁移,诱导肾癌细胞程序性凋亡的机制;（4）探索肾癌细胞对TRAIL产生耐药性的分子机制,并寻找治疗策略。方法:通过数据库中DR4和DR5的mRNA表达数据,分析死亡受体在肾癌细胞和正常肾组织中的表达差异;通过MTS法检测肿瘤细胞活力;通过细胞增殖实验,Edu染色增殖实验和成克隆实验检测肿瘤细胞的增殖能力;通过平板划痕愈合实验检测肿瘤细胞的迁移能力。通过流式细胞学技术检测细胞周期和细胞凋亡;通过蛋白免疫印迹检测各相关蛋白表达水平;通过小分子RNA干扰和慢病毒包装感染方法制备目的基因沉默的细胞系;通过荧光实时定量PCR技术检测细胞转录水平的变化。结果:（1）死亡受体蛋白表达水平在肾癌中高于正常组织,因此TRAIL可以作为潜在治疗剂靶向治疗肾癌。肾癌细胞中DR5的蛋白表达水平明显高于正常组织,但是DR4的蛋白表达水平,相较于DR5,增高不明显;（2）DR4蛋白表达水增高可以增强肾癌对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性;（3）穿心莲内酯或PFT-β与TRAIL联合应用可以显着抑制肾癌的细胞活力,增殖能力和迁移能力,诱导肾癌细胞周期阻滞和细胞衰老,诱导肾癌细胞Caspase依赖的程序性凋亡;（4）敲低突变体p53诱导肾癌细胞DR4蛋白表达水平升高,恢复肾癌对TRAIL的敏感性。结论:可以通过上调DR4恢复肾癌对TRAIL的敏感性;穿心莲内酯和PFT-β是安全有效的潜在的TRAIL增敏剂,联合应用成为潜在的肾癌治疗药物;突变体p53诱导肾癌细胞DR4表达下降,是肾癌对TRAIL抵抗的机制之一。
王彭[4]（2021）在《miR-612对膀胱癌增殖侵袭的抑制作用及机制研究》文中研究说明研究背景膀胱癌是泌尿系常见的恶性的肿瘤,是世界上第五大常见癌症,发病率和死亡率逐年呈现上升趋势。膀胱癌分为肌层浸润性（MIBC）和非肌层浸润性（NMIBC）膀胱癌。在膀胱癌中,肿瘤分期显示其浸润膀胱壁的深度,其中肿瘤浸润到粘膜层和固有层分别被定义为Ta和T1期,归类于非肌层浸润性膀胱癌,而T2,T3和T4期,已侵犯肌层,归类于肌层浸润性膀胱癌。NMIBC约占膀胱癌的70%,低风险患者其5年生存率约为43%,中度风险患者5年生存率约为33%,而高风险患者进展为MIBC的比例高达21%。NMIBC和MIBC分别具有不同的转移潜能。NMIBC通常是非侵袭性的上皮细胞来源肿瘤,而MIBC是一种侵袭性的上皮细胞来源肿瘤,MIBC早期全身性播散率较高,约三分之一的患者发生局部浸润或远处转移。在转移扩散过程中,癌细胞局部侵入周围组织,进入血液和淋巴微血管,并通过血液循环转移到远处组织的微血管,并适应这些组织的微环境,促进了继发性肿瘤的定植、增殖和微观结构的形成。因此,在局部和远处转移之前及早发现膀胱癌将极大地提高患者的生存期和生活质量。近年来,新兴的生物物理方法加速了从分子水平上认知膀胱癌发生机制的进程。此外,一些研究已经证实,microRNAs（miRNA/miR）与包括膀胱癌在内的多种癌症发病机制密切相关。MicroRNA在不同的物种之间进化,到目前为止,已经在271个物种中鉴定出38589个miRNA分子。一张microRNA基因图谱包括大约1%的不同物种的基因组,但每个物种都有大量的靶基因,大约30%的编码基因受microRNAs的调控。miRNA簇是小的内源性非编码RNA,由大约19-24个核苷酸组成,在转录后调节靶基因。miRNAs在肿瘤细胞的生长、分化、转移和凋亡中起关键作用。研究表明,miRNAs参与了多种癌症的发展,包括肝癌、胃癌、膀胱癌和胶质瘤等。在这些肿瘤中,miRNAs对基因表达起着中心调节作用。因此,本课题将深入研究microRNAs在膀胱癌发生和发展中的调控作用。miRNAs是一类高度保守的非编码小RNA,在蛋白编码基因的表达调控中起着至关重要的作用,miRNAs既可以作为癌基因发挥作用,也可以作为肿瘤抑制因子发挥作用。这些miRNAs在细胞生物行为过程中发挥作用,如细胞周期、细胞生长、凋亡、细胞程序死亡以及癌细胞下游的信号通路。它们可以调控泌尿系统肿瘤的信号传导通路,已有研究发现miRNAs在膀胱癌和肾癌等肿瘤中失调。miRNAs是参与信号传导过程不同阶段的关键角色。它们的作用方式主要取决于它们可能发挥组织或器官特异性功能的靶基因。超过40个miRNAs与泌尿系癌症有关,其中许多miRNAs针对常见的致癌途径。miRNAs调控细胞增殖、上皮细胞间充质转化（EMT）、肿瘤侵袭途径、血管生成信号,并调控超过三分之一的人类基因的表达。miRNAs可以调节细胞重编程、细胞骨架动力学、神经发育和可塑性。miRNAs通过靶向几个影响大量转录本的mRNA来控制细胞代谢;因此,其失调影响了许多与癌症相关的过程,如增殖、分化、凋亡和转移。miRNAs通过部分或全部与mRNA3’端非翻译区（3’UTR）的互补序列结合来抑制其靶mRNA的翻译过程,从而通过转录后基因沉默来稳定mRNA转录本。到目前为止,许多miRNAs已经被认为与膀胱癌的进展和转移有关。研究表明,某些miRNAs如miR-21和miR-210在膀胱癌中表达上调,miR-143在膀胱癌中表达下调,这种低表达调控Ras在膀胱癌中的表达。一些miRNAs如miR-133a、miR-30-3p和miR-199a通过调节CRT7活性参与膀胱癌生长的调控。miRNA可作为肿瘤细胞抑制因子,影响细胞生物行为包括迁移、侵袭、增殖和凋亡等,例如miR-106a、miR-223和miR-613,它们分别通过调节MAPKs、NCOA1和SPHK1而发挥作用。miR-124-3p通过靶向Rho连接蛋白激酶1（ROCK1）减少膀胱癌细胞的迁移和进展,并通过靶向含有PHD和uhrf1的泛素样蛋白,抑制膀胱癌的细胞生长和血管生成。miR-124还可通过直接作用于细胞周期蛋白D激酶（CDK-4）来抑制膀胱癌的生长。miR-409-3p通过靶向c-Met减少膀胱癌细胞的迁移和进展。miR-130、miR-200和miR-556等作为癌基因分别通过调控PTEN、RECK和DAB2IP在膀胱癌中发挥重要作用。miR-150-5p通过靶向PDCD4,增加膀胱癌的侵袭力。由于包括突变、缺失、扩增或转录变化在内的基因组事件,miRNAs在包括癌症在内的几种疾病中调节失调。有研究证实,在尿液细胞外囊泡中可以发现miRNAs,并且它们被保护不被降解,这使得miRNAs成为膀胱癌中有希望的预后标记物。一项从血液样本中识别miRNAs用于NMIBC诊断的研究发现,该诊断指数的准确率超过90%,可用于在转移前发现早期和低、高级别的癌症。以上研究证实,miRNAs是膀胱癌早期检测的一种非侵入性、有效的生物标志物。microRNA对蛋白质表达进行转录后控制,导致蛋白质表达被抑制,从而控制多个检查点受体的表达。有大量证据表明,microRNA及其生物发生机制参与了癌症的发展。利用miRNA模拟物在体内调节miRNA的表达和活性,为膀胱癌治疗提供了新的途径和策略。miRNA模拟物已经被用来补充具有肿瘤抑制功能的miRNA,经过化学修饰后具有更高的稳定性或能够定向输送到肿瘤。研究目的本研究探讨miR-612在膀胱癌组织中的表达水平,然后评估miR-612在膀胱癌细胞系的生物学行为和裸鼠移植瘤中的表达效果,并通过生物信息学分析预测miR-612的靶基因,通过实验予以确认,并研究靶基因调节的信号通路。本课题力图为miR-612在膀胱癌发生发展中的作用提供新的有见地的信息,为进一步研究miR-612作为膀胱癌新的肿瘤生物标志物或治疗策略提供帮助。实验方法1.收集膀胱癌患者的膀胱癌组织及其配对癌旁组织以及膀胱癌细胞系5637、T24和正常膀胱细胞系SV-Huc1做为研究对象,采用荧光实时定量PCR技术（qRT-PCR）检测miR-612的表达情况。2.通过对5637和T24膀胱癌细胞株体外转染miR-612 miminc（模拟体）的方式来进行一系列获得性功能实验。以CCK-8、Transwell小室侵袭实验来分析miR-612过表达对肿瘤细胞增殖与迁移侵袭功能的影响,并构建裸鼠皮下移植瘤动物模型,制备人miR-612基因组慢病毒,感染T24细胞后筛选稳定过表达miR-612的细胞株,体内研究miR-612对膀胱癌生长的影响。3.利用在线生物信息学工具,预选miR-612作用的靶基因为跨膜前列腺雄激素诱导蛋白1（PMEPA1）,构建PMEPA1 3’UTR的双萤光素酶报告基因载体,根据萤光素酶活性鉴定PMEPA1是否为miR-612的靶基因。miR-612 mimics转染T24和5637细胞,Western Blot检测PMEPA1蛋白表达;构建PMEPA1过表达质粒,将其（或空白质粒）与miR-612 mimic（或miR-NC）共转染,观察miR-612/PMEPA1对膀胱癌细胞生物学行为的影响。4.收集PMEPA1过表达质粒（或空白质粒）与miR-612 mimics（或miR-NC）共转染T24和5637细胞,收集各组细胞蛋白,检测miR-612/PMEPA1对Hippo通路的调控作用。5.收集临床膀胱癌及癌旁标本,用免疫组化方法检测在膀胱癌及癌旁组织中PMEPA1、YAP1、LATS1 的表达水平。6.本研究中所有统计分析均采用SPSS 20.0软件进行。连续变量数据采用平均值±标准差表示。各组间的差异通过单因素方差分析来比较。组间的多重比较采用Tukey’s检验来分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。实验结果1.mi R-612在人膀胱癌标本和细胞系中的表达的特点1.1 m i R-612在膀胱癌组织中表达较其配对正常癌旁组织明显降低我们收集膀胱癌组织以及与其配对的正常癌旁组织临床标本,应用qRT-PCR方法检测了所收集组织中miR-612的表达情况。结果显示,miR-612在膀胱癌组织中表达水平明显低于其配对的癌旁组织。1.2对比人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,miR-612在膀胱癌细胞系T24,5637中的表达显着降低我们以人膀胱上皮永生化细胞SV-Huc-1为对照组,以膀胱癌细胞系T24,5637为实验组,应用qRT-PCR检测miR-612的表达情况。结果显示,miR-612在膀胱癌细胞系T24,5637中表达水平明显低于膀胱上皮永生化细胞SV-Huc-1。2.miR-612对膀胱癌细胞生物学行为的影响2.1在膀胱癌细胞系T24和5637中,增强miR-612的表达（1）利用miR-612 mimcs转染膀胱癌细胞T24和5637,于转染后48h提取细胞总RNA,检测转染前后细胞中miR-612的表达情况,结果显示miR-612的表达显着上调。（2）慢病毒包装、感染T24细胞后,观察感染效率超过80%。对稳转T24细胞提取RNA进行qPCR检测,实验组较对照组细胞miR-612表达显着升高,miR-612过表达的T24细胞系成功构建。2.2 miR-612过表达抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭（1）miR-612过表达可以抑制膀胱癌细胞T24和5637的增殖。CCK-8检测结果显示:与对照组比较,在膀胱癌细胞T24和5637中,miR-612-mimic在96h时增殖效率明显降低,差异具有统计学意义。（2）miR-612过表达可抑制膀胱癌细胞T24和5637的侵袭能力。应用Transwell小室实验验证:转染miR-612 mimic组的膀胱癌细胞T24和5637侵袭速度较对照组显着降低。2.3 miR-612过表达抑制裸鼠皮下肿瘤的生长Lv-miR-612或Lv-con慢病毒包装、感染T24细胞后,将其分别注射入裸鼠皮下进行裸鼠成瘤实验。结果显示,皮下注射Lv-miR-612转染组膀胱癌细胞的裸鼠（实验组）体内肿瘤体积较皮下注射Lv-con转染组膀胱癌细胞的裸鼠（对照组）体内肿瘤体积明显减小。称重并计算瘤体重量,实验组瘤体重量明显小于对照组。对裸鼠皮下瘤包埋、切片,并进行HE染色,光镜下见Lv-miR-612组肿瘤细胞呈长梭形、卵圆形,核大深染,核膜清晰,核浆比例增大,异型性明显,核分裂相易见,胞浆丰富,肿瘤细胞结构完整,可见病理分裂相。对照组瘤体细胞变性凋亡,胞核断裂,细胞结构紊乱。TUNEL检测裸鼠膀胱癌移植瘤细胞凋亡情况,Lv-miR-612组细胞凋亡率明显升高,结果提示miR-612可以抑制裸鼠体内膀胱癌的增殖。3.miR-612靶基因的鉴定及其调控机制的研究3.1双荧光素酶报告基因证实PMEPA1为miR-612靶基因过表达miR-612（以对照RNA转染作为对照）显着抑制含PMEPA1 3’UTR wt基因的报告载体表达,而不能抑制含PMEPA1 3’UTR mut基因的报告载体表达,对照组两种情况均不能抑制报告载体表达。3.2通过TCGA分析PMEPA1在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达差异及生存分析从TCGA数据库整理下载膀胱癌的HT-seq数据,共有肿瘤样本408个,正常样本19个。PMEPA1的Ensembl ID为“ENSG00000124225”。在膀胱癌中PMEPA1表达明显高于正常膀胱组织,PMEPA1高表达的患者生存期明显低于PMEPA1低表达患者。3.3 Western-blot检测PMEPA1在膀胱癌细胞系中的表达采用Westerm-blot方法检测PMEPA1在不同细胞系中的表达情况,与膀胱上皮永生化细胞SV-Huc-1相比,PMEPA1在膀胱癌细胞系5637和T24中的表达明显升高。3.4 CCK-8实验检测PMEPA1过表达对膀胱癌细胞增殖能力的影响CCK-8实验结果证实,与对照组相比,PMEPA1过表达组可显着促进膀胱癌细胞系T24及5637细胞的增殖。3.5Transwell实验检测PMEPA1对膀胱癌细胞侵袭能力的影响Transwell实验证实,与对照组相比,在T24及5637膀胱癌细胞系中PMEPA1过表达组侵袭细胞数量明显增多,计数细胞数量并计算平均值,结果显示PMEPA1组可显着增强膀胱癌细胞的侵袭能力,差异具有统计学意义。3.6 Transwell实验检测PMEPA1与mi R-612 m i m i c共转染对5637膀胱癌细胞侵袭能力的影响与对照组比较,PMEPA1与miR-612 mimic共转染后侵袭细胞数量增多,计数细胞数量并计算平均值,结果显示:PMEPA1与miR-612 mimic共转染可逆转miR-612 mimic对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。3.7 Western-blot检测PMEPA1过表达对膀胱癌细胞Hippo通路中主要蛋白的表达的影响以T24及5637细胞系为研究对象,在Hippo通路中选择6个重要因子进行研究,包括LATS1、MST1、NDR1、TAZ、YAP1、MOB。结果显示与对照组比较,PMEPA1过表达使T24及5637细胞LATS1、MST1、NDR1蛋白表达量降低,而TAZ、YAP1、MOB蛋白表达量升高。3.8在膀胱癌细胞5637中Western-blot检测miR-612过表达及miR-612与PMEPA1共转染对Hippo通路中重要蛋白的表达的影响选择Hippo通路中研究较多的抑癌蛋白LATS1和肿瘤蛋白YAP1进行验证,与对照组相比,miR-612 mimic增强了 LATS1的表达,PMEPA1与其共转染后逆转了这种增强作用,抑制了 LAST1的表达,miR-612 mimic抑制了 YAP1的表达,PMEPA1与其共转染后逆转了这种抑制作用,增强了 YAP1的表达,同样PMEPA1与miR-612 mimic共转染可逆转miR-612 mimic对PMEPA1表达的抑制作用。3.9免疫组化检测在膀胱癌及癌旁组织中PMEPA1、YAP1、LATS1的表达水平膀胱癌组织中PMEPA1的表达相对于癌旁组织,表达量增加,膀胱癌组织中YAP1的表达相对于癌旁组织,表达量增加,膀胱癌组织中LATS1的表达相对于癌旁组织,表达量降低。实验结论1.miR-612在膀胱癌组织及膀胱癌细胞系T24、5637中表达水平降低。2.miR-612过表达可抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡。3.膀胱癌细胞中PMEPA1是miR612的靶基因,miR-612通过抑制PMEPA1蛋白的表达使Hippo通路的活化,抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭。
狄倩[5]（2021）在《E3泛素连接酶SIAH1在膀胱癌中的功能研究及泛素化底物探索》文中研究说明[研究背景]膀胱癌是世界第四大男性常见恶性肿瘤,是全球的一大疾病负担。在中国,膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,占我国泌尿生殖系肿瘤发病率之首。但是近十年来,膀胱癌的诊断治疗和5年生存率几乎没有变化。相对于其他类型的肿瘤,膀胱癌的靶向疗法的研究明显落后。SIAH1（seven in absentia homolog 1）是一种 RING 型泛素连接酶,其结构上包含RING finger结构域、两个zinc finger结构域和底物结合结构域。其被报道与许多肿瘤密切相关,但在不同肿瘤当中,由于其泛素化底物蛋白不同,SIAH1所发挥的功能也不同。目前,SIAH1对于膀胱癌的发生发展的作用尚不明确,其作为泛素连接酶在膀胱癌细胞中的泛素化底物也未曾报道。因此本文围绕SIAH1与膀胱癌发生发展的关系及其在膀胱癌中的底物展开研究。[研究目的]明确SIAH1在膀胱癌发生发展过程中的功能,并探索膀胱癌中SIAH1的泛素化底物,深入研究SIAH1在膀胱癌中发挥作用的分子机制,为寻找膀胱癌的新药物靶点和靶向治疗提供理论基础。[研究方法]应用膀胱癌cDNA芯片和组织芯片分析SIAH1在膀胱癌组织中mRNA水平和蛋白水平的变化情况;利用CCK-8实验和克隆形成实验研究SIAH1对膀胱癌细胞增殖能力的影响;利用细胞迁移、侵袭及划痕实验探究SIAH1对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响;应用差异蛋白质组学分析寻找SIAH1在膀胱癌中的潜在泛素化底物,并利用半衰期实验、细胞内泛素化实验、免疫共沉淀实验和细胞外泛素化实验鉴定底物蛋白;利用流式细胞术研究SIAH1对膀胱癌细胞凋亡的影响;利用SIAH1点突变体研究其连接酶活性与膀胱癌细胞侵袭能力之间的关系。[研究结果]1、SIAH1在膀胱癌组织中mRNA水平上调,蛋白水平上升。利用膀胱癌cDNA芯片进行qPCR实验,实验结果显示SIAH1在膀胱癌组织中mRNA水平上调;利用膀胱癌组织芯片进行免疫组化实验,结果显示SIAH1在膀胱癌组织中高表达。2、SIAH1促进膀胱癌细胞的增殖能力。CCK-8实验和克隆形成实验结果显示,过表达SIAH1的膀胱癌细胞具有更强的增殖和克隆形成能力,相反,敲低SIAH1的细胞的增殖和克隆形成能力较弱。3、SIAH1促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。浸润和转移是引起肿瘤患者术后复发甚至死亡的主要原因。为明确SIAH1在膀胱癌转移中的作用,我们通过划痕愈合实验和Transwell迁移、侵袭实验发现过表达SIAH1的膀胱癌细胞具有更强的迁移和侵袭能力,相反,敲低SIAH1可以减弱膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。4、Caspase-3是SIAH1在膀胱癌中的泛素化底物。通过差异蛋白质组学分析寻找膀胱癌中SIAH1的潜在底物,利用半衰期实验、细胞内泛素化实验、免疫共沉淀实验和细胞外泛素化实验,鉴定出泛素化底物Caspase-3。我们发现SIAH1招募底物Caspase-3,并通过促进Caspase-3的K48型-泛素化修饰和蛋白酶体降解,影响Caspase-3的半衰期和蛋白质稳定性。5、SIAH1抑制膀胱癌细胞的凋亡。我们的实验结果显示,敲低SIAH1提高膀胱癌细胞中的Caspase-3蛋白水平和活性,凋亡相关蛋白的水平明显升高,膀胱癌细胞的凋亡水平升高;过表达SIAH1后膀胱癌细胞的凋亡阈值升高,凋亡水平受到抑制。6、SIAH1通过介导Caspase-3的降解影响膀胱癌细胞表型。实验结果显示SIAH1 C75S突变体由于不具备泛素连接酶活性,因此不具备促进膀胱癌细胞侵袭的能力。我们还发现过表达Caspase-3同样可以抑制膀胱癌细胞的侵袭,这与敲低SIAH1的结果一致。[研究结论]SIAH1在膀胱癌中发挥着促进肿瘤发展的作用;SIAH1促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;Caspase-3是膀胱癌中SIAH1的泛素化底物;SIAH1通过介导Caspase-3的泛素化降解,抑制膀胱癌细胞的凋亡,促进膀胱癌细胞的侵袭能力。[研究意义]本研究揭示SIAH1在膀胱癌中的促癌作用及其泛素化底物,进一步补充SIAH1的生物学功能,并且为膀胱癌寻找新的分子靶点提供理论基础和新思路。
廖新惠[6]（2021）在《LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究》文中研究表明研究背景和目的:膀胱癌（bladder cancer,BC）是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤,特点是高复发和浸润进展。10%-20%浅表性膀胱癌会进展为肌层浸润性膀胱癌,肌层浸润性膀胱癌5年生存率<50%。因此,揭示膀胱癌的侵袭转移机制,寻找肿瘤特异性标志物和治疗靶点,应用于膀胱癌的精准治疗迫切重要。研究表明长链非编码RNA（LncRNA）在转录调控、肿瘤发生发展中发挥着重要作用。前期通过对膀胱癌及对应的癌旁正常组织进行高通量测序,筛选了一批LncRNA,发现LOWEG在膀胱癌中的表达有显着差异。LOWEG是一种新发现的LncRNA,首次被发现是在胃肠道肿瘤中。目前LOWEG在膀胱癌中迁移、侵袭的机制尚不清楚。本研究探讨LOWEG在膀胱癌中的表达水平,与膀胱癌患者临床病理特征的相关性;LOWEG对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖能力及EMT的影响;LOWEG抑制膀胱癌进展的分子机制研究。方法:1.采用RT-qPCR测定LOWEG在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中的表达水平,分析LOWEG的表达水平与膀胱癌患者临床病理征的关系。2.通过感染LOWEG慢病毒载体,构建稳转过表达LOWEG的膀胱癌细胞株,采用划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验、Edu实验和Western Blot检测LOWEG过表达对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖能力及EMT的影响。3.通过免疫组化、RT-qPCR检测LIFR在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中的表达。通过RT-qPCR、Western Blot检测膀胱癌细胞中LOWEG和LIFR关系。通过高通量测序和生物信息学软件预测、RT-qPCR检测寻找膀胱癌细胞中LOWEG和LIFR可能靶向结合的miRNA。采用RT-qPCR、双荧光素酶报告基因实验、Western Blot检测LOWEG、miRNA和LIFR的作用关系。4.通过Transwell实验检测LIFR对膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响。通过Transwell实验检测沉默LIFR对过表达LOWEG的膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响。结果:1.膀胱癌组织中LOWEG的表达低于癌旁正常组织。膀胱癌细胞中LOWEG的表达低于人正常膀胱上皮细胞。LOWEG表达水平与患者的性别、组织学分级、肿瘤T分期、T3-T4期患者的淋巴结转移存在相关性,而与患者的年龄、肿瘤大小等临床病理特征无明显相关性。2.过表达LOWEG抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭和EMT,对膀胱癌细胞增殖没有影响。3.LIFR在膀胱癌中低表达。过表达LOWEG促进LIFR在膀胱癌细胞中的表达,LOWEG与LIFR在膀胱癌中的表达呈正相关关系。LOWEG作为miR-629的分子海绵正向调控LIFR的表达。4.LIFR抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭。沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制。结论:LOWEG在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中低表达。LOWEG作为miR-629分子海绵调控LIFR的表达,进而抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。研究结果表明LOWEG有望作为膀胱癌的治疗的靶点。
黄厚锋[7]（2021）在《KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究》文中研究说明[目的]探讨KNTC1基因在膀胱癌发生发展中的作用及可能机制。[方法]使用包括46例患者的膀胱尿路上皮癌组织和癌旁移行上皮组织以及13例其他患者的膀胱尿路上皮癌组织的膀胱癌组织芯片,采用免疫组化方法检测KNTC1在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达水平,并分析KNTC1表达水平与膀胱癌病例各种临床特征之间及总生存的相关性。采用RNA干扰技术敲低EJ和T24膀胱癌细胞系KNTC1表达,通过MTT实验检测细胞增殖能力,通过流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期,通过划痕实验检测细胞迁移能力,通过Transwell实验检测细胞侵袭能力。通过动物体内成瘤实验,检测敲低KNTC1表达的T24膀胱癌细胞系在裸鼠体内成瘤情况。采用蛋白抗体芯片和Western blot检测KNTC1基因敲低后相关蛋白表达水平的变化,探讨其可能的调控机制。[结果]免疫组化结果显示,KNTC1在膀胱癌组织中表达显着高于癌旁组织,在不同病理分级（Ⅱ级和Ⅲ级）、不同T分期（Tis/T1/T2期和T3/T4期）以及不同临床分期（Ois/1/2期和3/4期）的表达有显着性差异,更高级别的病理分级、T分期和临床分期KNTC1表达高于低级别的病理分级、T分期和临床分期。KNTC1基因的高表达是总生存的危险因素,高表达的死亡风险是低表达的3.139倍。细胞功能实验结果显示,与对照组相比,KNTC1敲低组膀胱癌细胞增殖显着减慢,凋亡显着增加,G2期细胞百分率显着升高,迁移侵袭能力显着受到抑制。体内成瘤实验结果显示,与对照组相比,KNTC1敲低组T24细胞的致瘤能力受到明显抑制。蛋白抗体芯片检测结果显示,KNTC1基因敲低后Caspase3,Fas的表达水平显着上调,蛋白Bcl-2,Bcl-w,CD40,clAP-2,HSP60,IGF-Ⅰ,IGF-1sR,Livin,sTNF-R2,TNF-α,TNF-β,XIAP的表达水平显着下调。Western blot检测结果显示,蛋白MAPK9表达上调,蛋白P-Akt,CDK6,PIK3CA表达下调。[结论]KNTC1在膀胱癌中高表达,与临床病理特征和预后显着相关。敲低KNTC1表达可抑制膀胱癌细胞的增殖,增加凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,并抑制肿瘤生成,提示KNTC1在膀胱癌的发生发展中起着重要的作用,可作为膀胱癌的一种生物标志物和潜在的治疗靶点。KNTC1基因敲低可改变凋亡信号通路蛋白的表达水平,提示KNTC1通过影响凋亡信号通路发挥作用。
周小满[8]（2020）在《唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究》文中提出唾液酸是一种以九个碳原子作为骨架的酸性糖,常以单体或多聚形式存在于糖链末端。细胞以葡萄糖为底物,经过一系列酶催化过程合成唾液酸,最终由唾液酸转移酶将唾液酸添加至糖链中。已证实唾液酸在肿瘤的发生发展过程中具有重要的生物学功能,例如帮助肿瘤细胞躲避免疫系统监控,促进肿瘤相关血管生成,促进肿瘤细胞增殖和迁移,增加肿瘤细胞对化学治疗和放射线治疗的抵抗。唾液酸修饰受唾液酸转移酶和唾液酸酶共同调控。唾液酸转移酶在肿瘤组织中常高表达,且有助于癌细胞累积唾液酸修饰,但唾液酸酶在肿瘤中的作用仍存在争议。膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤,也是泌尿系统中最常见的肿瘤,男性发病率较高。膀胱癌因进展迅速且治疗方法有限,严重威胁着患者生存质量。本文以膀胱癌为主要的研究模型,结合基于质谱的糖组学和蛋白组学技术,研究了唾液酸修饰和膀胱癌发生发展的关联及分子机理,并探索了小细胞外囊泡唾液酸修饰在囊泡内吞过程中的作用,此外还针对唾液酸修饰,改进了基于质谱检测唾液酸不同键型的样品制备方法。主要结论如下:（1）改进基于滤膜的唾液酸质谱样品制备方法,使用二甲胺/氨水衍生化方法区分α2,3和α2,6连接唾液酸。该方法基于α2,3唾液酸与临近半乳糖形成内酯的特性,在EDC和HOBt的催化下,使用二甲胺和氨水对α2,3和α2,6唾液酸进行不同衍生化,借助质谱区分二者。以唾液酸化乳糖（α2,3唾液酸修饰乳糖和α2,6唾液酸修饰乳糖）及糖蛋白（胎球蛋白和重组人乳铁蛋白）为模型,验证了该样品制备及衍生化方法可以有效鉴定两种方式连接的唾液酸修饰。继而利用该方法分析了肿瘤细胞在常氧和低氧状态下的N-糖修饰变化。该方法在鉴定N-糖链结构的同时能表征唾液酸α2,3和α2,6连接类型,扩展了质谱所获得的糖组信息。（2）膀胱癌唾液酸修饰的异常增加与唾液酸酶NEU1低表达有关。经高通量N-糖组学分析发现恶性膀胱癌细胞含有较多唾液酸修饰。检测唾液酸酶活性,发现膀胱癌唾液酸修饰增加与总唾液酸酶活性低有关。经高通量蛋白质谱检测,发现膀胱癌细胞表达的唾液酸酶主要为NEU1,且恶性膀胱癌细胞NEU1表达量较低。使用凝集素和NEU1抗体荧光染色、激光共聚焦等实验检测,发现膀胱癌细胞NEU1表达量与唾液酸修饰呈负相关趋势。分析临床样本发现膀胱癌患者癌组织中NEU1的表达水平显着低于癌旁组织,且NEU1表达量与唾液酸修饰负相关,NEU1的低表达预示着患者有更短的生存期。（3）唾液酸酶NEU1催化降低纤维连接蛋白（FN）的唾液酸修饰,抑制由整合素α5β1介导的Akt磷酸化和细胞增殖。通过慢病毒感染的方式构建了高表达NEU1的膀胱癌细胞株YTS-1/NEU1。经检测YTS-1/NEU1细胞唾液酸修饰显着减少,且细胞增殖减缓、凋亡增加,细胞周期G0/G1期占比增加。经蛋白相互作用实验和免疫共沉淀等实验证实,部分NEU1定位于细胞膜并导致FN的去唾液酸化,而FN唾液酸修饰影响其与整合素α5β1的亲和力。因此FN去唾液酸修饰致使由整合素介导的与细胞黏附相关的信号通路减弱,促进细胞内吞并降解整合素α5β1和FN,导致细胞增殖减缓,凋亡增加。利用裸鼠皮下成瘤实验证明在体内条件下NEU1可以减少唾液酸修饰,降低FN、整合素α5β1表达并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。（4）小细胞外囊泡（sEV）的唾液酸修饰影响其被受体细胞摄入,可为膀胱癌临床诊断提供参考。通过凝集素印迹实验和ELISA等实验发现膀胱癌细胞分泌的sEV含有丰富的唾液酸修饰。膀胱癌细胞sEV能被正常膀胱细胞摄入,且激活其Akt信号通路,促进细胞增殖。对sEV的去唾液酸处理明显降低了其进入受体细胞的速率,且弱化了sEV对细胞的Akt通路的激活。通过检测48例膀胱癌患者和30例健康志愿者血浆和血浆sEV的唾液酸修饰水平,发现膀胱癌患者血浆和血浆sEV唾液酸修饰均显着高于健康志愿者。且以sEV唾液酸修饰水平作为膀胱癌检测指标,有较高准确性,可为临床诊断膀胱癌提供参考。
刘娇[9]（2020）在《MiR-214靶向netrin-1降低膀胱癌细胞的顺铂耐药性及其机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:膀胱肿瘤是世界范围内最常见的肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中膀胱癌的发病率居第八位,死亡率居前十位。高达70%的膀胱肿瘤患者最初诊断为非肌层浸润性膀胱癌,25%的膀胱癌患者在诊断之初已有肌层浸润,属浸润性膀胱癌。这类肿瘤在细胞病理分级上多表现为低分化或未分化,常早期发生微转移,即使采取放、化疗等综合治疗手段,预后也较差,浸润性膀胱癌多以手术切除和顺铂为核心的新辅助化疗治疗。虽然以顺铂为核心的新辅助化疗显示了对晚期膀胱癌的良好疗效,但是患者对顺铂产生的耐药造成了其使用的局限性。目前需要攻克的临床难点在于增强膀胱癌患者对顺铂药物的敏感性和减少膀胱癌的复发率。因此,寻找治疗浸润性膀胱癌的有效方法,一直是膀胱癌基础研究领域的重大课题,而对浸润性膀胱癌治疗的研究仍需要从其发生、发展的分子病理基础入手进行多角度的深入探讨。在本研究中原癌基因netrin-1的异常活化是促进膀胱癌肿瘤恶性进展的分子机制之一,可促进肿瘤细胞增殖并且降低顺铂的化疗敏感性。UNC5B是netrin-1依赖性受体之一,具有诱导肿瘤细胞凋亡作用,结果显示:netrin-1/UNC5B在膀胱癌中存在表达并参与癌细胞凋亡。并且miR-214的过表达可以逆转netrin-1造成的肿瘤进展。通过报告基因分析,体外功能实验等方法,力图证实netrin-1/miR-214调控膀胱癌的侵袭转移和耐药的产生。方法:选取人膀胱癌细胞系5637,T24,BIU-87,SV-HUc-1,RT-4和J82,通过细胞培养,收集细胞并提取总RNA和总蛋白,同时收集2008年至2015年在中国医科大学附属第一医院泌尿外科收集手术中切除的膀胱癌及癌旁组织标本,提取总RNA和总蛋白,采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测netrin-1、UNC5B、MiR-214的mRNA表达量,免疫印迹实验（Western-blot）检测netrin-1、UNC5B蛋白的表达量,免疫荧光和免疫组织化学检测netrin-1/UNC5B表达及定位,并分析其与临床病理参数关系,通过摇菌、质粒提取,细胞瞬转和稳转miR-214,细胞增殖实验（CCK-8）,克隆形成实验,EdU细胞增殖检测实验,流式细胞仪细胞凋亡检测细胞的增殖和凋亡,从而分析netrin-1、UNC5B、miR-214在膀胱癌细胞系及组织中的表达水平及对膀胱癌细胞的功能作用,进一步证实miR-214通过下调netrin-1促进膀胱癌细胞对顺铂耐药的敏感性。结果:Real time PCR&Western-blot分别从RNA及蛋白水平检测netrin-1/UNC5B的表达,发现UNC5B在癌旁组织中的表达与膀胱癌组织相比明显高并且在低级别膀胱癌组织中的表达高于高级别癌组织,netrin-1则相反。Netrin-1/UNC5B的高/低表达与膀胱癌的临床分期、病理分级及转移相关,同时Pearson相关分析显示netrin-1和UNC5B的表达成负相关。Real time PCR&Western-blot从RNA及蛋白水平检测膀胱癌细胞系（T24、BIU-87、5637和SV）中netrin-1/UNC5B的表达水平,UNC5B在正常膀胱细胞系SV中表达高,而在恶性度高的T24细胞系中表达低,netrin-1则相反。免疫荧光结果显示UNC5B在膀胱癌细胞浆中表达而netrin-1在细胞浆及核中均存在表达。采用RT-qPcR检测30例新鲜膀胱癌组织及相应正常组织miR-214的表达,与正常组织相比,miR-214在癌组织中的表达水平显着下调,miR-214在膀胱癌细胞株中表达下调,抑制细胞增殖和侵袭,用顺铂（10μg/ml）对T24和J82细胞进行CCK-8检测,结果表明miR-214增加膀胱癌细胞对顺铂的化学敏感性,miR-214模拟物转染可将J82和T24细胞系顺铂治疗24小时后的凋亡率显着上调,miR-214的转染模拟下调总caspase-3和总PARP表达,上调裂解的caspase-3和切割的PARP表达。利用Target Scan软件对miR-214的潜在靶点进行预测,结果表明netrin-1是miR-214的靶基因之一,转染miR-214后,netrin-1蛋白和mRNA的表达显着下调。将具有netrin-1野生型（ccU-GcU-G）和突变型（ccU-uu-G）3’-UTR结合位点的报告子与miR-214模拟物一起导入J82细胞,荧光素酶报告物分析表明,miR-214模拟物与对照组相比明显抑制了野生型报告物的荧光素酶强度,以上数据表明,miR-214与netrin-1的3’-UTR结合降低其mRNA和蛋白的表达。与未接受顺铂治疗的细胞相比,顺铂（2和5微克/毫升持续2天）诱导J82和T24细胞的蛋白质表达增加。用5μg/ml顺铂处理的细胞的在mRNA有显着增加。Annexin V/PI分析表明,与对照组相比,netrin-1过表达会明显抑制顺铂诱导的细胞凋亡。Westernblot显示netrin-1基因转染上调AKT磷酸化。结论:miR-214的表达在膀胱癌组织中下调,并与肿瘤分期淋巴结状态和肿瘤分级显着相关。尿中无细胞miR-214水平可作为非肌肉浸润性膀胱癌复发的独立预后指标。miR-214通过下调癌基因PdRG1的表达在膀胱癌中发挥抑癌作用。在本研究中,miR-214在膀胱癌组织和细胞系中的表达水平被下调。miR-214对膀胱癌细胞增殖和侵袭的抑制作用在本研究中也得到了验证。然而,其在膀胱癌细胞抗药性发展中的作用尚待探索。因此,本研究探讨miR-214对J82和T24细胞化疗耐药的影响。结果表明,miR-214模拟物通过上调细胞凋亡率显着降低耐药率。检测一系列凋亡相关蛋白,结果显示,转染miR-214模拟物后,总caspase-3和总PARP表达水平降低,而裂解的caspase-3和裂解的PARP明显上调。这些结果表明miR-214促进细胞凋亡。此外,AKT信号通过上调Bcl-2家族蛋白参与细胞凋亡的调控。因此,miR-214对化疗耐药的影响可能依赖于其对AKT/Bcl-2信号的调节。本研究进一步探讨了miR-214调控细胞凋亡和耐药的机制。利用Target Scan软件预测miR-214的潜在靶基因,确定netrin-1为靶基因之一。netrin-1质粒转染显着下调膀胱癌细胞凋亡,显着上调AKT磷酸化。此外,miR-214可显着降低netrin-1 mRNA和蛋白表达水平。在膀胱癌组织中miR-214和netrin-1的mRNA表达水平呈负相关。此外,荧光素酶报告分析显示miR-214可以直接与netrin-1的3’-UTR结合,这表明netrin-1是miR-214的直接靶点。这些结果共同表明miR-214下调了netrin-1,而netrin-1又反过来抑制pAKT和降低化疗抵抗力。Netrin-1质粒转染修复miR-214下调的顺铂耐药性。综上所述,这些数据表明miR-214通过靶向netrin-1抑制膀胱癌的化疗耐药性。
尉春晓[10]（2019）在《核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究》文中研究说明研究背景膀胱癌的发病率在泌尿生殖系统恶性肿瘤中位居前列,每年全世界大约有43万人被诊断为膀胱癌。如此庞大的患病人群,不仅对泌尿外科、肿瘤科等相关领域的临床和基础工作者提出了严峻的挑战,更是对经济社会发展造成了巨大的负担。因此,如何更早期准确的诊断、更精准有效的治疗成为摆在膀胱癌基础和临床工作者面前的一道难题。膀胱癌的发生、发展、对各种治疗方案的疗效反应和预后,均与其分子生物学特征密切相关。目前,膀胱癌的分子生物学研究已经进入了一个崭新的发展阶段,这得益于膀胱癌基因组学、转录组学和蛋白质组学方面基础理论的不断完善和相关实验技术的迅猛发展。目前膀胱癌的诊断仍主要依赖于膀胱镜检查,但是作为一种有创性检查,膀胱镜检查不仅给患者身体带来不可避免的痛苦,增加了患者的心理负担,而且有尿路感染、出血和尿道损伤的风险。因此,临床上急需一种创伤小、敏感性和特异性均高的无创性检查方法来协助膀胱癌的诊断。尿液脱落细胞学检查作为一种无创性的诊断方法,一开始被寄予厚望,但是由于其敏感性和特异性均不高,尚无法取代膀胱镜在膀胱癌诊断中的主导地位。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,分子肿瘤标记物在膀胱癌无创性诊断中的研究也日新月异,但是目前尚无一种标记物被指南推荐可以取代膀胱镜检查的地位,仍需更多更加深入细致的基础和临床研究来寻找和筛选理想的膀胱癌分子标记物。对于转移性膀胱癌等晚期患者,目前临床上的治疗以全身化疗为主,但是20多年以来膀胱癌的一线全身化疗药物主要是基于顺铂的方案,无明显进展。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,膀胱癌的靶向治疗迎来了发展的新阶段。靶向治疗的目标是干扰肿瘤特异性的信号通路,其中一些靶向治疗的药物已经进入临床试验阶段。但是由于膀胱癌的多样性和个体差异,单纯一种或几种靶向药物无法有效治疗所有的晚期膀胱癌。因此,仍需更多的基础和转化研究来为临床治疗提供更多更有效的靶向药物。PNO1基因位于人染色体2p14,由7个外显子和6个内含子组成,其编码的PNO1蛋白是一种核仁蛋白。核糖体是细胞合成蛋白质的场所,被誉为“细胞的蛋白质工厂”,由大小两个亚基组成,许多蛋白都参与到了核糖体小亚基成熟的晚期阶段,其中就包括PNO1蛋白。目前有关PNO1基因的基础研究非常少,而该基因在人膀胱癌中的表达情况和作用机制,目前尚无深入系统的研究。本研究力求通过研究PNO1基因在膀胱癌中的表达情况和作用机制,能为膀胱癌的分子肿瘤标记物诊断和靶向治疗提供新的、有价值的理论依据和实验基础。研究目的本研究拟通过检测PNO1基因在膀胱癌临床标本和细胞系中的表达情况,分析其与膀胱癌病理分级和临床分期的关系;拟利用RNA干扰技术靶向干扰PNO1基因,然后进行体内外实验以研究其对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并探究可能的下游基因和相关通路。实验方法1.PN01基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究1.1免疫组织化学染色法检测膀胱癌标本中PN01蛋白的表达将石蜡包埋的人膀胱癌临床标本进行免疫组织化学染色,然后在显微镜下观察组织切片,进行视野拍照,并采集图像。根据显微镜下观察到的染色范围和染色程度这两个方面进行评分来判定蛋白表达情况,并研究其与肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。1.2实时定量PCR检测膀胱癌细胞系中PN01基因的表达首先设计合适的PCR反应所需要的引物,再提取人膀胱癌细胞系T24和5637中的RNA,同时提取对照细胞系人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中的RNA,反转录获得cDNA,在配置完成反应体系后,进行实时定量PCR（Real-time PCR）检测,最后采用仪器自带软件进行数据分析。2.干扰PN01基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究2.1 PN01基因的RNA干扰靶点设计、慢病毒载体构建首先以PNO1基因为模板,设计干扰靶点,再根据干扰靶点序列设计shRNA干扰序列,进行RNA干扰慢病毒载体的构建,获得携带RNA干扰靶点序列的慢病毒载体。2.2 PN01基因的RNA干扰慢病毒包装首先进行质粒转染,然后进行慢病毒收获与浓缩:收集转染后的293T细胞上清液,经高速离心等处理后收获上清,获得PNO1-shRNA慢病毒颗粒,按要求分装在病毒管中,-80℃保存。2.3 PN01-shRNA慢病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞将GFP（绿色荧光蛋白）标记的PNO1-shRNA慢病毒和对照组病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞,感染后72 h左右,使用荧光显微镜观察GFP的表达情况,筛选出细胞状态良好的感染效率合格组,用于下游检测。2.4检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达情况（1）实时定量PCR检测mRNA水平PNO1基因敲减效率将5637和T24人膀胱癌细胞分为两个实验组:shCtrl组（阴性对照病毒感染组）和shPNO1组（PNO1基因shRNA慢病毒感染组）。然后采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后其mRNA的表达量。（2）Western Blotting检测靶点干扰后PN01基因的蛋白水平表达将5637和T24人膀胱癌细胞分为shCtrl组和shPNO1组两个实验组,然后将细胞样本裂解后提取细胞内的总蛋白,再进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（转膜）、抗体杂交,最后行X光显影。2.5检测干扰PN01基因对5637和T24人膀胱癌细胞生长和增殖的影响（1）Cel igo细胞计数检测细胞生长将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后进行铺板,每天用Celigo细胞计数仪检测一次,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量,根据细胞计数值和时间点,绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线和基于细胞增殖倍数的生长曲线。（2）细胞活力检测先将经过胰酶消化后处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞悬液进行铺板、培养,然后依次加入噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT）和二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒颗粒,最后用酶标仪检测其吸收值,进行数据统计分析。（3）细胞克隆形成检测先将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后,制成细胞悬液、进行接种培养,荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照。最后用多聚甲醛固定细胞、GIEMSA染液染色,用数码相机拍照、计算克隆数。2.6流式细胞仪检测干扰PNO1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响首先将shCtrl组和shPNO1组细胞接种于6孔板上,常规培养,诱导凋亡,于感染后第5天用胰酶消化,制成细胞悬液,再进行离心、Annexin V-APC染色,最后上机检测处于凋亡状态的细胞数量来检验PNO1基因与细胞凋亡的关系。2.7筛查PNO1基因的下游基因并进行Western Blotting验证分别提取shCtrl组和shPNO1组的总RNA,体外反转扩增后置入基因芯片中进行杂交、洗染、扫描,获得数据,筛选出有显着差异表现的基因,利用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析软件对差异基因结果进行分析,初步筛查出PNO1基因调控的下游基因,并绘制出基因网络图。最后对筛查出的PNO1基因的下游基因进行Western Blotting验证。2.8研究PNO1基因的下游调控通路使用IPA基因通路分析软件,对基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的800条信号、代谢通路进行整合分析,初步筛查出差异基因富集的信号通路。然后使用 PathScan（?）Intracellular Signaling Antibody Array Kit（信号通路蛋白抗体芯片）检测和比较shCtrl组和shPNO1组中信号通路关键信号分子的变化,研究PNO1基因在膀胱癌中的相关调控通路。实验步骤包括细胞裂解、孵育,与抗体检测液、HRP、化学发光试剂反应,显影成像和分析。2.9实时定量PCR检测PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因的表达采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达情况,以验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。3.干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究3.1建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组成瘤细胞经过胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,按照每组10只裸鼠将准备好的成瘤细胞注射至裸鼠右侧腋下的皮下组织内,仔细喂养裸鼠并观察生长状况。3.2移植瘤体积重量测量和活体成像检测每周收集两次常规观察指标的数据,包括裸鼠重量、移植瘤瘤体长短径等。在皮下注射成瘤细胞36天后进行活体成像检测,结束后处死裸鼠,取出肿瘤,拍摄裸鼠和移植瘤照片,称重、测量、整理数据。3.3免疫组织化学染色法检测移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达情况先将瘤体组织进行石蜡包埋固定,再进行切片、脱蜡和水化处理,然后对瘤体切片进行Ki67抗体标记,经显色与封片后于显微镜下观察,拍照,然后进行数据整理和分析。3.4实时定量PCR检测移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况采用实时定量PCR方法检测膀胱癌移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况,以研究干扰PNO1基因对移植瘤组织细胞凋亡的影响。3.5实时定量PCR检测干扰PNO1基因对移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响采用实时定量PCR方法检测干扰PNO1基因对膀胱癌移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响,在体内条件下验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。4.统计分析使用SPSS 25.0对数据进行统计分析。根据数据类型选择相应的统计分析方法,计数资料选用卡方检验或Fisher精确检验,计量资料选用方差分析或t检验。以平均值±标准差表示计量资料,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1.1 PN01蛋白在膀胱癌组织中均阳性表达并且与病理分级和临床分期有关免疫组化染色显示PNO1蛋白在正常膀胱组织中表达很少,而在低级别和高级别膀胱癌组织中则均阳性表达。分别按照临床分期和病理分级将膀胱癌标本进行分组对比研究,结果显示临床分期越晚,病理分级越高,PNO1蛋白的表达越高。1.2 T24和5637人膀胱癌细胞中PN01基因的mRNA表达升高采用实时定量PCR方法检测了 T24和563 7这两种膀胱癌细胞中PNO1基因的mRNA表达量,通过与人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中PNO1基因的mRNA表达量进行对比分析,结果显示在T24和5637细胞中PNO1基因均有高丰度的mRNA表达。2.1 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞系的构建成功利用RNA干扰技术构建了 PNO1基因敲减质粒,经慢病毒包装、感染,从而建立了 PNO1低表达的5637和T24膀胱癌细胞系模型。2.2 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达明显下调（1）实时定量PCR方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其mRNA的表达量显着下降实时定量PCR检测结果显示,经PNO1基因shRNA慢病毒感染后,与shCtrl组相比,shPNO1组5637细胞和T24细胞中PNO1基因在mRNA水平的表达量均受到抑制,敲减效率分别达到58.6%和71.5%。（2）Western Blott i ng方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其蛋白表达量显着下降Western Blotting方法检测PNO1基因干扰后5637和T24人膀胱癌细胞中相应蛋白的表达量,结果显示shPNO1组中PNO1蛋白表达水平较shCtrl组显着降低,具有统计学差异。2.3 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的生长和增殖受到明显抑制（1）Celi go细胞计数检测细胞生长Celigo细胞计数仪观察结果显示,自扫板观察的第3天开始,shPNO1组的细胞数量开始逐渐下降,而shCtrl组细胞数量仍然持续增加,表明shPNO1组膀胱癌细胞的增殖受到明显的抑制。（2）细胞活力检测MTT法检测结果显示,shPNO1组膀胱癌细胞在酶标仪对波长490nm光的吸收率明显低于shCtrl组,提示shPNO1组膀胱癌细胞的增殖活力受到明显的抑制。（3）细胞克隆形成检测shPNO1组的克隆形成数量和平均克隆数明显低于shCtrl组,具有统计学差异,表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组细胞的克隆形成能力受到明显的抑制,提示干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖有抑制作用。2.4 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的细胞凋亡率明显增加流式细胞仪检测结果显示,shPNO1组的细胞凋亡率明显高于shCtrl组,具有统计学差异（p<0.01）。这表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组的细胞凋亡数量增加,提示PNO1基因有抑制膀胱癌细胞凋亡的作用。2.5基因芯片联合IPA分析初步筛查出PNO1基因的下游基因采用基因芯片技术初步筛选出了在shCtrl组和shPNO1组中基因表现有显着差异的基因,结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组的上调基因数有675,下调基因数868。然后在IPA数据分析软件中输入基因芯片分析的差异基因结果,初步筛查出了 PNO1基因调控的下游基因CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,F3,CXCL8 和 FOSL1。2.6 Western Blotting验证后确定PN01基因的下游基因Western Blotting方法检测结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组中除F3蛋白外,CD44蛋白、CCND1蛋白、FOSL1蛋白、PTGS2蛋白、CDK1蛋白和CXCL8蛋白表达均显着下调。这提示PNO1基因在T24膀胱癌细胞通过调控CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8 和 FOSL1 基因发挥作用,F3 基因则被排除。2.7 PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌细胞的增殖通过IPA分析软件整合分析基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的信号通路,初步筛查出包括mTOR信号通路在内的十大信号通路。然后使用抗体芯片检测,结果显示shPNO1组中的多个信号通路关键蛋白均下调,其中mTOR和p70 S6激酶的表达水平显着下调,具有统计学意义。这提示PNO1基因通过调控mTOR、p70 S6激酶所在的mTOR信号通路进而对膀胱癌细胞的增殖产生影响。2.8 PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达下调实时定量PCR检测结果显示,PNO1基因干扰后5637和T24膀胱癌细胞中shPNO1组的mTOR基因mRNA的表达量明显低于shCtrl组。3.1干扰PNO1基因可抑制T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长定期观察shCtrl组和shPNO1组裸鼠的生长状况、测量裸鼠的体重和肿瘤大小,结果显示,随着时间的延长,两组移植瘤模型之间肿瘤体积的差距逐渐加大。shPNO1组的肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于shCtrl组,表明体内条件下抑制PNO1基因的表达,可导致膀胱癌细胞在体内增殖速度减低,同时致瘤能力也受到抑制。3.2活体成像显示干扰PN01基因后T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长受到抑制对两组裸鼠进行了活体成像检测,获得了每只实验裸鼠的区域内总荧光表达量等相关观察指标。结果显示shPNO1组的区域内总荧光表达量为明显低于shCtrl组,具有统计学差异,提示干扰PNO1基因可在体内条件下抑制膀胱癌细胞的增殖和移植瘤的生长。3.3干扰PNO1基因后移植瘤中Ki67蛋白表达明显下调利用免疫组化染色法对裸鼠移植瘤瘤体组织中细胞增殖标记物Ki67蛋白表达情况进行了对比分析,结果显示shPNO1组瘤体组织中Ki67阳性细胞百分比明显低于shCtrl组,表明干扰PNO1基因会使膀胱癌细胞在体内的增殖受到抑制。3.4干扰PNO1基因后移植瘤组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高实时定量PCR结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组瘤体组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,提示干扰PNO1基因可在体内条件下促进细胞凋亡。3.5干扰PN01基因后移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达下调实时定量PCR结果显示,shPNO1组瘤体组织中mTOR基因mRNA表达量明显低于shCtrl组,提示在体内条件下PNO1基因通过调控mTOR通路对移植瘤的生长增殖产生影响。实验结论1.在人膀胱癌临床标本和细胞系中,PNO1基因均阳性表达,并且肿瘤的临床分期和病理分级越高,PNO1蛋白的表达量也越高。2.体外实验中干扰PNO1基因后膀胱癌细胞的生长状况、细胞活力和克隆形成能力均受到显着抑制,而凋亡数量明显增加,表明PNO1基因在膀胱癌中具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。进一步的机制研究表明,PNO1基因通过调控mTOR信号通路对膀胱癌细胞的生长增殖产生影响,并且CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8和FOSL1等基因参与其中。3.体内实验中干扰PNO1基因后裸鼠膀胱癌移植瘤的生长状况和活体荧光表达量受到显着抑制,瘤体组织的Ki67蛋白表达水平明显降低,Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,mTOR基因mRNA表达下调,表明体内条件下干扰PNO1基因可通过调控mTOR信号通路,有效抑制膀胱癌细胞的增殖、促进凋亡。
二、Fas和Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Fas和Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤转移 |
| 1.2 膀胱癌概述 |
| 1.3 Pokemon在肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 IGFBP3在肿瘤中的研究进展 |
| 1.5 拟采取的技术路线 |
| 第2章 Pokemon在膀胱癌组织中的表达及生物学功能 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验步骤和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Pokemon在膀胱癌组织和细胞中明显上调 |
| 2.3.2 Pokemon表达水平与临床病理特点的联系 |
| 2.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达Pokemon |
| 2.3.4 Pokemon促进膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 2.3.5 Pokemon影响膀胱癌细胞的粘附作用 |
| 2.3.6 Pokemon促进膀胱癌细胞抵抗失巢凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Pokemon通过调控IGFBP3表达影响膀胱癌转移 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验步骤与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IGFBP3在膀胱癌中低表达 |
| 3.3.2 IGFBP3与临床病理特征的关系 |
| 3.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达IGFBP3 |
| 3.3.4 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 3.3.5 IGFBP3影响膀胱癌细胞的粘附能力 |
| 3.3.6 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的失巢凋亡抵抗能力 |
| 3.3.7 IGFBP3影响黏着斑的形成 |
| 3.3.8 Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进膀胱癌转移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制及对RIG-1 通路的调控作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验步骤与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Pokemon影响IGFBP3启动子甲基化程度 |
| 4.3.2 Pokemon通过IGFBP3调节RIG-1信号通路 |
| 4.3.3 Pokemon-IGFBP3通路可以调节膀胱癌体内转移 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 膀胱癌免疫治疗的研究进展 |
| 一、卡介苗的研究进展 |
| 二、免疫检查点抑制剂 |
| 三、小结 |
| 第二节 巨噬细胞作为膀胱癌治疗靶点的研究进展 |
| 一、巨噬细胞的研究进展 |
| 二、巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用 |
| 三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对膀胱癌的作用 |
| 四、巨噬细胞作为治疗靶点的抗膀胱癌研究 |
| 五、小结 |
| 第三节 中药多糖免疫调节作用的研究进展 |
| 一、中药多糖的开发与中医理论的渊源 |
| 二、中药多糖的免疫调节作用 |
| 三、中药多糖的免疫调节功能在疾病中的研究进展 |
| 四、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润程度与膀胱癌恶性程度的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究 |
| 一、THP-1来源巨噬细胞模型的建立及HPP对巨噬细胞的极化作用 |
| 二、HPP活化的巨噬细胞对于人膀胱癌细胞的直接作用及分子机制研究 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肾癌背景知识 |
| 1.1.1 肾癌概况 |
| 1.1.2 肾癌治疗方法简介 |
| 1.2 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的背景知识 |
| 1.2.1 TRAIL及其受体 |
| 1.2.2 TRAIL的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 TRAIL耐药性的机制 |
| 1.2.4 恢复TRAIL敏感性的策略 |
| 1.3 穿心莲内酯的背景知识 |
| 1.4 PFTβ 的背景知识 |
| 1.5 结语与前景展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 死亡受体基因的mRNA表达差异分析 |
| 2.5 细胞体外实验 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 细胞计数法检测细胞增殖能力 |
| 2.5.3 Edu检测试剂盒检测细胞增殖能力 |
| 2.5.4 MTS法测定药物IC50(半数抑制浓度)值 |
| 2.5.5 MTS法检测细胞活力 |
| 2.5.6 细胞划痕实验 |
| 2.5.7 细胞克隆形成实验 |
| 2.5.8 细胞衰老染色实验 |
| 2.5.9 BCA法标定蛋白样品浓度 |
| 2.5.10 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.5.11 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.5.12 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.5.13 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.5.14 细胞转染 |
| 2.5.15 利用sh-RNA构建稳定的基因敲低细胞系 |
| 2.6 统计学检测方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 肾癌和邻近正常肾组织中的DR4和DR5的mRNA表达差异分析 |
| 3.2 通过MTS方法检测TRAIL对肾癌细胞系的细胞活力的影响 |
| 3.3 穿心莲内酯对肾癌786-0细胞DR4和DR5表达水平的影响 |
| 3.4 通过MTS方法检测穿心莲内酯对肾癌786-0细胞的细胞活力的影响并测定其IC50值 |
| 3.5 MTS方法检测联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞活力的影响 |
| 3.6 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.6.1 应用细胞计数实验检测肾癌细胞的增殖能力 |
| 3.6.2 应用Edu检测试剂盒检测肾癌细胞的增殖能力 |
| 3.6.3 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.7 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.8 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞细胞周期和细胞衰老的影响 |
| 3.9 应用穿心莲内酯可以增强TRAIL诱导的肾癌细胞凋亡 |
| 3.10 穿心莲内酯增强TRAIL诱导的细胞死亡依赖于半胱天冬酶(Caspase)家族 |
| 3.11 穿心莲内酯通过上调DR4增强TRAIL的抗肿瘤作用 |
| 3.12 穿心莲内酯抑制肾癌786-0细胞突变体p53的蛋白表达水平 |
| 3.13 突变体p53的抑制剂可以上调肾癌786-0细胞DR4的蛋白表达水平 |
| 3.14 p53抑制剂增强TRAIL的抗肿瘤作用 |
| 3.15 p53突变诱导肾癌786-0细胞DR4低表达水平 |
| 3.16 p53突变诱导肾癌786-0细胞TRAIL的抗性 |
| 第4章 结果讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介以及攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）miR-612对膀胱癌增殖侵袭的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-612在人膀胱癌标本和细胞系中的表达的特点 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-612对膀胱癌细胞增殖侵袭能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 miR-612靶基因鉴定及其调控机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNAs在膀胱癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（5）E3泛素连接酶SIAH1在膀胱癌中的功能研究及泛素化底物探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一.膀胱癌cDNA和组织芯片、菌株、细胞株、质粒和实验动物 |
| 二.试剂与仪器设备 |
| 三.实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.SIAH1在膀胱癌组织中的表达 |
| 1.1 SIAH1在膀胱癌组织中mRNA水平上调 |
| 1.2 SIAH1在膀胱癌组织中蛋白水平上升 |
| 二.SIAH1影响膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力 |
| 2.1 构建稳定敲低/过表达SIAH1的膀胱癌细胞系 |
| 2.2 SIAH1促进膀胱癌细胞的增殖能力 |
| 2.3 SIAH1促进膀胱癌细胞迁移和侵袭 |
| 三.Caspase-3是SIAH1在膀胱癌中的泛素化底物 |
| 3.1 差异蛋白质组学分析寻找膀胱癌中SIAH1的潜在底物 |
| 3.2 Caspase-3是SIAH1在膀胱癌中的一个泛素化底物 |
| 四.SIAH1通过介导Caspase-3降解影响膀胱癌细胞凋亡及表型 |
| 4.1 敲低SIAH1促进膀胱癌细胞的凋亡 |
| 4.2 过表达SIAH1抑制膀胱癌细胞的凋亡 |
| 4.3 SIAH1通过介导Caspase-3降解影响膀胱癌细胞的表型 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间学术论文发表情况 |
| 原始实验数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第1章 LOWEG在膀胱癌中的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 LOWEG在膀胱癌组织及对应的癌旁正常组织的表达情况 |
| 1.2.2 LOWEG在不同膀胱癌细胞系中的表达情况 |
| 1.2.3 LOWEG在膀胱癌组织中的表达与临床病理特征的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第2章 LOWEG对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖和EMT的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 感染LOWEG慢病毒载体后膀胱癌细胞系中的LOWEG显着过表达 |
| 2.2.2 过表达LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 2.2.3 过表达LOWEG对膀胱癌细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 过表达LOWEG对膀胱癌细胞EMT的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 第3章 LOWEG在膀胱癌中作为miR-629分子海绵正向调控LIFR的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 LIFR在膀胱癌组织及对应的癌旁正常组织中的表达情况 |
| 3.2.2 LIFR在T24、5637膀胱癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2.3 过表达LOWEG对膀胱癌细胞LIFR表达的影响 |
| 3.2.4 LOWEG和LIFR可能靶向结合miR-629 |
| 3.2.5 下调LOWEG对膀胱癌细胞miR-629表达水平影响 |
| 3.2.6 miR-629和LOWEG靶向结合研究 |
| 3.2.7 miR-629和LIFR靶向结合研究 |
| 3.2.8 LOWEG、miR-629和LIFR在膀胱癌细胞中作用的研究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 第4章 沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 过表达LIFR对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 4.2.2 沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 长链非编码RNA在膀胱癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
（7）KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 第一部分 KNTC1在膀胱癌组织中的表达以及和临床病理特点的关系 |
| 第二部分 KNTC1体外体内核心功能验证 |
| 第三部分 细胞信号通路蛋白的检测 |
| 结果 |
| 第—部分 KNTC1在膀胱癌组织中的表达以及和临床病理特点的关系 |
| 第二部分 KNTC1体外体内核心功能验证 |
| 第三部分 细胞信号通路蛋白的检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 膀胱癌分子标志物的研究进展及临床应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 蛋白质的糖基化修饰 |
| 1.2.1 N-糖基化修饰 |
| 1.2.2 O-糖基化修饰 |
| 1.2.3 GPI锚定修饰 |
| 1.2.4 糖基化修饰的功能 |
| 1.3 唾液酸 |
| 1.3.1 唾液酸简介 |
| 1.3.2 哺乳动物体内唾液酸的代谢 |
| 1.3.3 唾液酸与肿瘤的关系 |
| 1.3.4 唾液酸的研究方法 |
| 1.4 膀胱癌 |
| 1.4.1 膀胱癌简介 |
| 1.4.2 膀胱癌分类 |
| 1.4.3 膀胱癌的治疗 |
| 1.4.4 膀胱癌与Akt信号通路 |
| 1.5 细胞外囊泡 |
| 1.5.1 细胞外囊泡的简介 |
| 1.5.2 sEV的糖修饰研究进展 |
| 1.6 本课题的立项依据、研究意义及主要研究内容 |
| 1.6.1 立项依据与研究意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 唾液酸α2,3和α2,6连键类型质谱检测样品制备方法改进 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 细胞及培养方法 |
| 2.2.5 低氧培养模型 |
| 2.2.6 细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.7 蛋白质定量 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 Lectin blot |
| 2.2.10 唾液酸的衍生化 |
| 2.2.11 N-糖链的释放 |
| 2.2.12 N-糖链的除盐 |
| 2.2.13 N-糖链的MALDI-TOF检测 |
| 2.2.14 质谱数据分析方法 |
| 2.2.15 数据统计方法及结果表示 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 MALDI-TOF区分唾液酸α2,3与α2,6 的原理分析 |
| 2.3.2 衍生化方法的有效性验证 |
| 2.3.3 胎球蛋白的N-糖链唾液酸分析 |
| 2.3.4 重组乳铁蛋白复杂N-糖链及唾液酸分析 |
| 2.3.5 肿瘤细胞低氧状态N-糖修饰及唾液酸修饰组学 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 膀胱癌唾液酸修饰与唾液酸酶NEU1的关联 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 细胞株及培养方法 |
| 3.2.5 总蛋白提取 |
| 3.2.6 Western blot实验 |
| 3.2.7 Lectin Blot实验 |
| 3.2.8 细胞总唾液酸酶活性测定 |
| 3.2.9 细胞N-糖链质谱 |
| 3.2.10 SILAC标记定量蛋白质谱 |
| 3.2.11 免疫组化和免疫荧光染色 |
| 3.2.12 激光共聚焦荧光显微镜检测 |
| 3.2.13 数据统计方法及结果表示 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 恶性膀胱癌唾液酸修饰增加 |
| 3.3.2 膀胱癌细胞总唾液酸酶活性分析 |
| 3.3.3 NEU1在膀胱癌细胞中的表达 |
| 3.3.4 NEU1在膀胱癌临床样本中的含量 |
| 3.3.5 临床样本中NEU1与唾液酸关系 |
| 3.3.6 NEU1与膀胱癌患者预后的关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 过表达NEU1对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响及机理分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.2.4 细胞及培养方法 |
| 4.2.5 过表达NEU1细胞构建 |
| 4.2.6 NEU1瞬时干扰 |
| 4.2.7 细胞总蛋白提取 |
| 4.2.8 细胞组分分离和提取 |
| 4.2.9 免疫共沉淀 |
| 4.2.10 Western blot |
| 4.2.11 Lectin blot |
| 4.2.12 细胞总唾液酸酶活测定 |
| 4.2.13 细胞表面唾液酸检测 |
| 4.2.14 MTS检测细胞增殖 |
| 4.2.15 细胞凋亡检测 |
| 4.2.16 细胞周期检测 |
| 4.2.17 激光共聚焦检测蛋白表达及定位 |
| 4.2.18 FN-Integrin亲和力检测 |
| 4.2.19 小鼠皮下成瘤实验 |
| 4.2.20 组织免疫化学染色 |
| 4.2.21 组织凋亡TUNEL染色 |
| 4.2.22 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建过表达NEU1的膀胱癌细胞株 |
| 4.3.2 过表达NEU1对细胞唾液酸修饰的影响 |
| 4.3.3 过表达NEU1对细胞表型的影响 |
| 4.3.4 过表达NEU1对膀胱癌细胞生长和抵抗凋亡相关分子表达的影响 |
| 4.3.5 过表达NEU1抑制膀胱癌的分子机理探究 |
| 4.3.6 过表达NEU1膀胱癌细胞小鼠皮下成瘤实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 膀胱癌细胞sEV唾液酸修饰对受体细胞摄入的影响及在临床诊断中的作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂及材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 试剂配制 |
| 5.2.4 细胞及培养方法 |
| 5.2.5 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.6 蛋白质含量测定 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 Lectin blot |
| 5.2.9 sEV提取 |
| 5.2.10 密度梯度离心纯化sEV |
| 5.2.11 透射电镜检测 |
| 5.2.12 sEV粒径分析 |
| 5.2.13 sEV内吞激光共聚焦制样及检测 |
| 5.2.14 sEV生物素标记及内吞检测 |
| 5.2.15 EdU细胞增殖检测 |
| 5.2.16 s EV唾液酸含量检测(ELISA) |
| 5.2.17 数据量化及统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 细胞分泌的sEV的分离与鉴定 |
| 5.3.2 sEV唾液酸修饰 |
| 5.3.3 sEV唾液酸修饰对受体细胞影响 |
| 5.3.4 血浆sEV与膀胱癌诊断 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 课题展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:附表 |
| 附录 Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）MiR-214靶向netrin-1降低膀胱癌细胞的顺铂耐药性及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 NETRIN-1/UNC5B在膀胱癌中存在表达 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及组织样本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 免疫印迹实验(Western-Blot) |
| 2.2.3 细胞瞬转和稳转 |
| 2.2.4 摇菌、质粒提取 |
| 2.2.5 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 2.2.6 EdU 细胞增殖检测实验 |
| 2.2.7 免疫荧光染色 |
| 2.2.8 免疫组织化学检测 |
| 2.2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 MIR-214对膀胱癌细胞的功能研究 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及组织样本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 免疫印迹实验(Western-Blot) |
| 2.2.3 细胞瞬转和稳转 |
| 2.2.4 摇菌、质粒提取 |
| 2.2.5 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 2.2.6 克隆形成实验 |
| 2.2.7 EdU细胞增殖检测实验 |
| 2.2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Mi R-214通过下调netrin-1促进膀胱癌细胞对顺铂耐药敏感性 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及组织样本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 免疫印迹实验(Western-Blot) |
| 2.2.3 细胞瞬转和稳转 |
| 2.2.4 摇菌、质粒提取 |
| 2.2.5 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 2.2.6 克隆形成实验 |
| 2.2.7 EdU细胞增殖检测 |
| 2.2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 基质胶侵袭测定 |
| 2.2.10 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.11 验证靶基因和miRNA相互作用 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PNO1基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第二部分 干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第三部分 干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌的分子生物学研究进展及其应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
四、Fas和Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究[D]. 韩健松. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用[D]. 贾文玉. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞[D]. 毕然. 吉林大学, 2021(01)
- [4]miR-612对膀胱癌增殖侵袭的抑制作用及机制研究[D]. 王彭. 山东大学, 2021(11)
- [5]E3泛素连接酶SIAH1在膀胱癌中的功能研究及泛素化底物探索[D]. 狄倩. 山东大学, 2021(12)
- [6]LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究[D]. 廖新惠. 南方医科大学, 2021(02)
- [7]KNTC1在膀胱癌发生发展中的作用及初步机制研究[D]. 黄厚锋. 北京协和医学院, 2021(02)
- [8]唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究[D]. 周小满. 江南大学, 2020(01)
- [9]MiR-214靶向netrin-1降低膀胱癌细胞的顺铂耐药性及其机制的研究[D]. 刘娇. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究[D]. 尉春晓. 山东大学, 2019(02)