【摘要】目的：研究观察腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统(以下简称AdKDR-CDg1yTK)对结肠癌的治疗作用并进行作用机理分析。方法：采用将人结肠癌细胞系SW620、LS174T移植接种于裸鼠腋下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将20只裸鼠每组五只随机分为四组。1组：注射重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5-FC和GCV；3组：注射重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK；4组：对照组。瘤体内多点注射重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK，5-FC和GCV采用腹腔内注射，观察各组裸鼠的状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理等指标；电镜观察细胞的超微结构，用TUNEL法检测细胞凋亡率，比较观察各治疗组的疗效；对各组的肿瘤组织行RT-PCR的检测，了解有无双自杀基因CDg1yTK的表达。结果：第1组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制，第2、3、4组肿瘤生长情况无明显差别。第1组肿瘤细胞凋亡指数较对照组显著增加（P=0.00）。结论AdKDR-CDg1yTK联合前药5-FC和GCV对人结肠癌SW620、LS174T细胞具有明显的靶向抑制作用，并可诱导裸鼠体内人结肠癌SW620、LS174T细胞凋亡。
【关键词】结肠肿瘤；自杀基因；裸鼠；细胞凋亡
【中图分类号】R735.35【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）02-0427-02
近年来，结肠癌的病例逐渐增多，治疗效果也不理想，尤其是手术后复发常常困扰着广大医务人员。随着分子生物学及基因工程的迅速发展，基因治疗已成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法成为近年基因治疗的研究热点[1-3]。自杀基因疗法是一种酶前药系统，即一些非哺乳动物基因表达的酶能将无毒或低毒的前药在宿主体内转换成有毒的化学物质，杀伤肿瘤细胞，自杀基因还能通过“旁观者效应”扩大杀伤范围，并可先转染后治疗及诱导免疫等特点从而达到更好的治疗效果。本研究旨在探讨AdKDR-CDg1yTK联合前药5-FC和GCV对结肠癌的治疗作用，以及该体系能否诱导体内结肠癌细胞的凋亡。证实其有效性，并探讨其作用机理，为结肠癌的基因治疗提供新思路和实验证据。
1材料、方法
1.1实验材料
重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK，293细胞，SW620、LS174T细胞。RPMI-1640、小牛血清、、PBS，GCV，5-FC。TrizolReagent试剂盒。CD-TK引物为：上游引物5＇-AGGCTAACAGTGTCGAATAACGCT-3＇,下游引物:5＇-GTTAGCCTCCCCCATCTC-3＇。SPFBa1b/c裸鼠,4-6周龄，雌性。
1.2实验方法
1.2.1重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定与鉴定见参考文献[4]。
1.2.2人结肠癌细胞SW620、LS174T培养。10%小牛血清的1640培养。37℃，5%二氧化碳孵箱培养，80%细胞融合按照1：2传代。
1.2.3重组腺病毒对SW620、LS174T细胞转染效率测定：2×105个细胞接种于6孔培养板，细胞丰度达约90％时，加入不同感染复数(multiplicityofinfection，MOI)的目的腺病毒继续培养，3d后在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞的百分比。
1.2.4裸鼠移植瘤模型建立、治疗：10%小牛血清RPMI-1640培养SW620、LS174T细胞，收集对数生长期的SW620、LS174T细胞，1000rpm离心后，在无血清RPMI-1640重悬，调节浓度，取细胞悬液0.1ml,含细胞数1.0×107，接种SW620、LS174T细胞1.0×107/个于小鼠腋下，肿瘤直径达到0.5cm时，随机分4组，每组5只。1组：注射重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5-FC和GCV；3组：注射重组腺病毒AdKDR-CDg1yTK；4组：空白对照。1组和3组瘤体内多点注射腺病毒，2次/周，共两周；第1次腺病毒注射24h后，1组于裸鼠腹腔内注射GCV(50mg/kg·d)、5-FC(500mg/kg·d)，连用14d；2组同时、同样、同量给药。瘤体内注射后每3d分别测量各组瘤体大小，计算方法：瘤体体积=a×b2/2mm3(a=长径，b=短径)计算瘤体体积及生长曲线；治疗结束后，处死裸鼠，取0.1mm3的肿瘤组织电镜观察。抑瘤率=(对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量，制作石蜡切片常规病理和免疫组化检查。
1.2.5肿瘤组织常规病理变化观察，免疫组化检测、细胞凋亡测定。肿瘤标本称重后，常规固定、包埋、切片，HE染色观察。用免疫组化SP法检测瘤组织中Bc1-2表达。测定细胞凋亡，用TUNEL标记法。取切片中最明显的阳性染色区，光学显微镜下计数凋亡细胞数，得出阳性细胞百分数为细胞凋亡指数（AI）。
1.2.6肿瘤组织电镜观察细胞超微结构。
1.2.7双自杀基因体内表达的RT-PCR检测：切取部分转基因组织，用Trizol试剂抽取RNA,进行RT-PCR反应，按TrizolReagent试剂盒说明行细胞总RNA提取，再按逆转录试剂盒说明合成cDNA，用CDglyTK的上下游引物进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.3统计学方法：实验样本采取单向方差分析。
2结果
2.1重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定
重组腺病毒转染293细胞后，GFP荧光表达24h后可见，3-5d时达高峰，7-10d收集细胞，反复扩增后经CsCL密度梯度离心后所得重组腺病毒滴度为2×1011pfu/ml。
2.2重组腺病毒感染率测定
用不同的重组腺病毒感染SW620、LS174T细胞，72h后见细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增：当MOI=1时，仅少数细胞有荧光；当MOI=100时，95%以上的GFP表达；MOI=200时，几乎所有的细胞被感染。
2.3裸鼠一般情况、肿瘤生长情况：
2.3.11组移植瘤表面光滑完整，一般情况、食欲、精神、皮肤无明显改变。2组、3组、4组裸鼠移植瘤表面不光滑，结节状，部分皮肤表面破溃。
2.3.2治疗结束时各组肿瘤标本称重结果及抑瘤率
1组：(45.6±4.3)mg，抑瘤率为87.85%；2组：(425.3±5.8)mg；3组：(432.8±5.6)mg，4组：(453.1±5.4)mg。组间瘤重差异有统计学意义(F=6598.65，P＝0.00)，1组与2、3、4组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，2、3、4组间瘤重无统计学意义(P＞0.05)。
2.3.3第1组、2组、3组、4组肿瘤生长曲线
1组肿瘤体积明显小于2、3、4组(P＜0.05)，而2组、3组、4组之间肿瘤体积无明显差异(P＞0.05)。
2.4光镜观察移植瘤形态学
光镜观察：对照组肿瘤细胞呈圆形，胞核圆形，居中，核分裂相多见，无区域性坏死组织，肿瘤细胞核大，深染，核分裂相增多、胞质少，无纤维组织增生及炎细胞浸润；治疗组见凋亡细胞，细胞体积缩小，胞质和核固缩，核碎裂，溶解，见凋亡小体，部分区域肿瘤细胞变性坏死，见炎细胞浸润。
2.5移植瘤细胞组织Bc1-2的表达检测
Bc1-2蛋白阳性染色呈棕褐色颗粒分布于细胞浆内。免疫组化染色：治疗组Bc1-2染色较对照组减弱。显示AdKDR-CDg1yTk联合前药5-FC和GCV可下调凋亡抑制基因Bc1-2表达。
2.6TUNEL法检测瘤细胞凋亡率
2、3、4组中有自发凋亡现象，散在于肿瘤组织，凋亡指数为(1.79±0.12)%，(2.06±0.28)%，(1.97±0.27)%；1组凋亡指数(33.80±4.50)%，组间差异有统计学意义(F=241.70，P＝0.00)，1组与2、3、4组间有统计学意义(P＜0.05)，2、3、4组之间无统计学意义(P＞0.05)。
2.7肿瘤组织电镜观察
治疗、对照两组SW620、LS174T细胞均有明显异形性，核大，不规则，呈中低分化癌特征。治疗组（1组）见大量凋亡细胞，核染色质浓聚，或核浓缩变小、碎裂，细胞浆浓缩、体积变小，胞浆内见核碎片和凋亡小体。对照组无明显变化。
2.8瘤组织目的基因表达RT-PCR检测
重组腺病毒转染的瘤组织经RT-PCR检测扩增出2.3kb片断。注射重组腺病毒肿瘤组织有目的基因CDglyTK表达，单纯注射前药组及对照组肿瘤组织无CDglyTK表达。
3讨论
实验结果表明：AdKDR-CDg1yTk联合前药5-FC和GCV对人结肠癌细胞有明显抑制作用。机理分析如下：
自杀基因治疗途径、方法：
1.HSV-tk治疗方法：HSV-tk能将无毒的药物前体丙氧鸟苷（GCV）转变为细胞毒性药物丙氧鸟苷三磷酸（GCVTP），GCVTP可进入DNA的合成从而杀伤肿瘤细胞。
2.CD/5-FC治疗方法：CD基因通过编码胞嘧啶脱氨酶将无毒的前体药物5-FC代谢成抗DNA合成的药物5-FU，达到杀伤肿瘤细胞的作用。双自杀基因较自杀基因具有更强的抗肿瘤作用及旁观者效应。
肿瘤血管之所以能持续生长关键是其血管内皮细胞的增殖能力，在肿瘤血管内皮细胞的增殖中，血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的因子[5]，VEGF与血管内皮细胞表面的VEGF受体（KDR）相结合，促使血管内皮细胞分裂、增殖。实验表明，KDR在结肠癌肿瘤血管及肿瘤组织中均高表达，而在正常组织中表达甚微。我们构建的载体AdKDR-CDg1yTk，可使自杀基因在结肠癌肿瘤细胞特异性表达，从而靶向性的杀伤结肠癌肿瘤细胞，同时也抑制了肿瘤新生血管的生成，达到了双重治疗作用。
许多实验已经证明，大肠癌、胰腺癌、乳腺癌等实体瘤与新生血管形成关系密切，在肿瘤原发灶及远处转移灶中可检测到高水平表达的血管内皮生长因子(VEGF)及其受体（KDR），因此其在多种肿瘤中分布，并与肿瘤的恶性转归明显相关，KDR在肿瘤血管及肿瘤组织细胞中均高表达，且正常组织表达甚微或不表达[6,7,8,9,10,11,]。本实验表明，双自杀基因系统治疗的移植瘤均出现较多的凋亡细胞，表明双自杀基因系统有促进肿瘤细胞凋亡的作用。这与我们既往的研究结果相一致[12]。体内细胞的凋亡是受一系列凋亡相关基因的调控，凋亡抑制基因如Bc1-2的表达及（或）凋亡活化基因如P53基因的缺失或突变都会导致凋亡受阻，从而导致肿瘤的发生[13]。根据文献报道[14-15]，以及我们实验中的免疫组化结果，说明该自杀基因系统可能是通过下调凋亡抑制基因Bc1-2的表达，从而诱导SW620、LS174T细胞的凋亡而发挥抗癌作用。可见，本实验所构建的载体AdKDR-CDg1yTk，可高效感染人结肠癌细胞株SW620、LS174T，结合前药并能杀伤肿瘤细胞。KDR启动子的引入保证了治疗的靶向性。双自杀基因系统抑瘤作用是其能够靶向性的诱导肿瘤细胞凋亡。
参考文献：
[1]FischerPM.Capinhand:targetingeIF4E.CellCycle.2009;8(16):2535-2541.
[2]CascanteA,Abate-DagaD,Garcia-RodríguezL,etal.GCVmodulatestheantitumouralefficacyofareplicativeadenovirusexpressingtheTat8-TKasalategeneinapancreatictumourmodel.GeneTher.2007;14(20):1471-1480.
[3]AufderklammS,TodenhöferT,GakisG,etal.Thymidinekinaseandcancermonitoring.CancerLett.2012;316(1):6-10.
[4]4.扬文宇，黄宗海，龚小卫，等。腺病毒介导双自杀基因选择性杀伤血管内皮细胞[J].中华胃肠外科杂志，2004，7(1):65-68
[5]DeroanneCF.Angiogenesisbyfibroblastgrowthfactor4ismediatedthroughanautocrineup-regulationofvascularendothelialgrowthfactorexpression[J].CancerReserch1997,57（24）:5590-5597
[6]桂松柏,鲁智,李柏青,吴穷.血管内皮细胞生长因子及其受体在乳腺癌组织的表达.肿瘤研究与临床.2002;14(4):227-231.
[7]闫振宇，栾静，钟勇等。Ad-KDR-GFP-CDglyTK融合基因系统治疗胰腺癌的实验研究。中国医药论坛。2009；7（10）:1-3
[8]闫振宇，陈旭，孔恒等。双自杀基因重组腺病毒对胰腺癌细胞特异性杀伤作用。中华肝胆外科杂志。2008；14（7）:489-492
[9]董育玮王兴鹏吴恺等.过氧化物酶增殖物活化受体γ在胰腺癌新生血管生成中的调节作用及其可能机制.中华消化杂志,2004;24(5):293-296
[10]苏国强，苏刚，黄宗海等。血管内皮生长因子受体启动子双自杀基因治疗乳腺癌。中华实验外科杂志。2010；27（11）:1398-1401
[11]李欣，张丽杰，任云会。抑癌基因INGI在乳腺癌中的表达及其临床意义。实用肿瘤学杂志。2011；25（3）:207-211
[12]黄宗海，李强，俞金龙，等。重组腺病毒介导的KDR-CDg1yTk基因诱导人胃癌细胞凋亡的研究[J].中华普通外科杂志，2007，22(3):176-180
[13]WuM.RepressionofBc1-2bythetumorsuppressoractivityofthelysyloxidasepropeptideinhibitstransformedphenotypeoflungandpancreaticcancercells[J].cancerres,2007,67(13):6278-6285
[14]FisherU,SteffensS,FrankS,etal.Mechanismsofthymidinekinase/ganciclovirandcytosinedeaminase/5-fluorocytosinesuicidegenetherapy-inducedcelldeathingliomacells.Oncogene[J].2005,24(7):1231-1243
[15]OkamotoK,OckerM,etal.Bc1-2-specificsiRNAsrestoreGemcitabinesensitivityinhumanpancreaticcancercells[J].JCellMolMed,2007,11(2):349-361
作者简介：
闫振宇，男，（1965-），本科，主任医师，研究方向：甲状腺、乳腺、胃肠、肝胆、胰脾、创伤等疾病。
科研项目:
深圳市龙华新区科技计划社会公益科研项目(20B060919061)