导读:本文包含了定点突变技术论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:水稻,IPA1基因,基因组编辑,突变体
定点突变技术论文文献综述
刘华清,孙庆山,杨绍华,周淑芬,王锋[1]（2019）在《利用基因组编辑技术定点突变IPA1基因创制水稻新株型材料》一文中研究指出【目的】水稻株型改良是提高水稻产量的一个有效途径。水稻理想株型基因IPA1是一个调控水稻株型的关键基因,利用基因组编辑技术(TALENs技术)定点突变水稻IPA1基因,了解IPA1基因不同序列变异的株型效应,为进一步利用IPA1基因创制实用型水稻新株型材料奠定基础。【方法】利用TALENs技术定点突变优良恢复系明恢86的IPA1基因,通过测序鉴定突变体,种植于标准小区,调查分析其株型相关性状。【结果】利用TALENs技术获得了8种不同序列突变的水稻ipa1突变体,并通过转基因植株自交结合PCR分析筛选到去除了TALENs表达框,获得4种不含外源转基因成分的纯合突变体材料(IPA1基因表达区分别缺失2、4、16、23 bp)。表型分析发现,IPA1基因突变能够显着改变水稻的株高、有效穗数、穗长及穗粒数等性状。与野生型比较,缺失移码突变体株高降低7.9%～11.4%,有效穗数增加46.9%～68.4%,穗长短24.2%～29.3%,穗粒数减少31%～34%,结实率和千粒重差异不明显。【结论】利用TALENs技术定点突变水稻IPA1基因能够明显改变水稻株高、有效穗数、穗长及穗粒数等主要性状,产生水稻新株型。(本文来源于《福建农业学报》期刊2019年08期）
李晨浩,车凤玉,王国霞,杨行,李辉[2]（2018）在《利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因定点突变的大鼠模型》一文中研究指出目的:利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因特定位点突变的大鼠模型。方法:根据FARS2基因序列,设计FARS2基因特异性的单链向导RNA(sgRNA)引物序列并克隆入p U57-T7-GDNA载体。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA。将体外转录的sgRNA/Cas9 mRNA显微注射入SD大鼠受精卵,通过PCR和基因测序对FARS2基因特定位点突变进行检测和鉴定。繁育FARS2基因敲除大鼠并分析后代突变情况。结果:基因测序证实成功构建表达sgRNA载体,成功将sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入大鼠受精卵。基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠。DNA测序结果证实5号大鼠(ID#5)发生了gac> tac突变,该突变并可遗传至子代大鼠。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功制备FARS2基因定点突变的大鼠模型,为进一步研究FARS2的功能奠定了基础。(本文来源于《神经解剖学杂志》期刊2018年06期）
徐旋[3]（2018）在《柑橘原生质体瞬时转化体系优化及利用CRISPR/Cas9技术定点突变山金柑基因》一文中研究指出柑橘是世界产量第一的水果,由于童期长、种子多胚、某些重要的商业品种育性低甚至不育等特点,利用传统的育种方法改良柑橘进展缓慢。CRISPR/Cas9系统作为近几年快速发展的基因组编辑技术可以精确有效地诱导特定的突变,特异地改造基因组,已成为植物基因功能研究和作物遗传改良的重要手段之一。利用植物原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统突变得到的植株,属于非转基因种质资源,能够省去漫长的后代筛选步骤;同时相对于农杆菌介导转化柑橘上胚轴易产生嵌合体,原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统是对于单个细胞进行基因编辑,得到纯合子的概率大大提高。由于柑橘原生质体瞬时转化体系尚未成熟,本研究旨在优化柑橘原生质体瞬时转化体系,提高柑橘叶肉原生质体瞬时转化效率,以充分利用亚细胞定位、双分子荧光互补(BiFC)实验对柑橘本物种基因进行功能研究;提高柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率,以利用CRISPR/Cas9系统改良柑橘种质;引进3种不同的CRISPR/Cas9载体的构建体系,并利用农杆菌介导山金柑上胚轴的遗传转化法对目的基因CsP5CS2进行敲除,以期得到阳性植株用于后期的基因功能研究。实验结果包括以下几方面:1、优化柑橘原生质体瞬时转化体系。1)真空渗透酶解法缩短酶解时间,界面离心法分离纯化原生质体,去除破碎的原生质体杂质和未被完全酶解的细胞团,大大提高分离得到的原生质体的完整性及活力至90%以上;2)改变柑橘原生质体瞬时转化过程的共转化处理方式,利用37℃水浴30 min共转化处理,使柑橘叶肉原生质体瞬时转化效率由19.10%显着提高至42.04%;3)提高PEG溶液Ca~(2+)浓度至30mmol/L,37℃水浴30 min共转化处理,使柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率由3.63%显着提高至13.18%。2、柑橘原生质体瞬时转化体系的应用。利用柑橘原生质体瞬时转化进行亚细胞定位实验,定位CsSPL3基因编码的蛋白于愈伤组织原生质体细胞核表达;利用柑橘叶肉原生质体瞬时转化进行BiFC实验,结果表明CsSPL14与CsARK1蛋白互作。3、CRISPR/Cas9定点突变山金柑CsP5CS2基因。以柑橘脯氨酸合成限速酶编码基因CsP5CS2为目的基因,利用CRISPR-P网站根据靶定位点设计2个gRNA,构建载体pKSE-GFP-CsP5CS2,通过根癌农杆菌介导的山金柑上胚轴遗传转化法,得到转基因阳性芽及植株,提取转基因阳性植株DNA并测序分析,结果表明,CRISPR/Cas9系统在山金柑中对目的基因CsP5CS2起到编辑作用且具有多种编辑结果,在PAM位点前3-4个碱基处产生2 bp、8 bp、50 bp缺失以及1 bp插入等情况。所得阳性植株可为于后续CsP5CS2基因功能研究。(本文来源于《华中农业大学》期刊2018-06-01）
金梦迪[4]（2018）在《利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因》一文中研究指出链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S突变是激活效果较为明显的两种突变。CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和pCas9-3。这叁种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。在海绵共附生链霉菌中,叁种质粒均无法成功实现定点突变,我们怀疑CRISPR-Cas9系统在目标宿主中工作异常,尤其是sgRNA和Cas9元件。即使在陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242中,也只有pCas9-2能成功编辑。我们通过半定量RT-PCR方法比较陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242转化叁种质粒后的sgRNA和Cas9的表达水平,结果显示pCas9-2的sgRNA和Cas9表达量介于两者之间,且sgRNA表达量高于Cas9。因此推测在海绵共附生链霉菌的基因组编辑操作中应当仔细调配sgRNA和Cas9的表达量,且合适的sgRNA和Cas9的摩尔比约为13:1。另外Cas9表达量不宜太高,否则很可能会伤害到宿主。这些推测需要引入Real-time RT-PCR等更精确的定量方法,对多种宿主开展更多实验验证。论文最后对rpsL K88E和P91S突变的S.coelicolor AS4.242突变株进行了初步的活性检测。结果显示,突变后的菌株对链霉素耐受性提高:从<2 μg/mL上升至70-80 μg/mL,表明对S.coelicolor AS4.242的核糖体工程操作成功。但目前还没有检出突变株的抑菌活性,可能实验比较初步,发酵和萃取等步骤没有优化,设计更精密的实验后才能判断是否有次级代谢基因簇因定点突变而被激活。(本文来源于《厦门大学》期刊2018-05-01）
王惠[5]（2017）在《利用定点突变技术改变耐盐木聚糖酶Xyn22酶活性和耐盐特性的研究》一文中研究指出木聚糖是自然界中含量最丰富的半纤维素,内切木聚糖酶是木聚糖降解中最重要的酶,具有耐盐特性的木聚糖酶在高盐食品加工,污水的处理以及利用海藻降解转化为生物乙醇等领域都具有重要的应用价值。实验室前期发现了一个具有良好耐盐特性的GH11家族木聚糖酶Xyn22,本研究拟采用定点突变等方法进一步提升Xyn22的热稳定性和比活性,并通过定点突变研究影响Xyn22耐盐特性的关键氨基酸位点,为解析木聚糖酶Xyn22的耐盐机理奠定基础。根据文献报道、序列比对和蛋白结构模拟分析,推测Xyn22的T10位点可能与其比酶活相关;采用重迭延伸PCR技术成功构建了 T10Y突变体重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达和蛋白纯化。酶学性质分析结果表明:(1)突变体T10Y的最适反应温度为65℃,比野生型提高了 5℃; (2)突变体T10Y的热稳定性也显着增强,在50℃处理60 min后,其剩余酶活基本保持不变;(3)突变体T10Y的比活力由野生型的220.22 U/mg提高至360.50 U/mg;Km值由野生型的17.38 mg·ml-1降低至11.11 mg ·ml-1。(4)突变体T10Y同样具有与野生型一样的的耐盐特性。蛋白表面酸性氨基酸的增加可能是导致蛋白耐盐特性的主要原因。本研究通过序列比对和蛋白结构模拟分析推测Xyn22的表面酸性氨基酸残基D50、E137、E139、D167和E169可能与其耐盐特性相关。为了探讨这些表面酸性氨基酸对Xyn22耐盐特性的影响,我们分别构建了突变体D50A、E137A、E139、D167A/E169、E137A/D167A/E169A和E139A/D167A/E169A,并在大肠杆菌中进行诱导表达和蛋白纯化。结果表明,与野生型相比,在5MNaCl条件下,突变体E137A相对酶活性为40.42%,突变体 E137A/D167A/E169A 和 E139A/D167A/E169A 的相对酶活性分别为19.39%和36.76%,都显着低于野生型的相对酶活性50.21 %。有意思的是突变体D167A/E169A的耐盐能力得到了进一步提升,在2-5MNaCl条件下,突变体D167A/E169A的相对酶活高于野生型Xyn22的相对酶活。综上所述,本研究通过单点突变体T10Y可以显着提高木聚糖酶Xyn22的比活力和热稳定性,此外发现木聚糖酶Xyn22表面酸性氨基酸E137、D167和E169位点是影响木聚糖酶Xyn22耐盐特性的关键氨基酸,为进一步解析GH11家族木聚糖酶耐盐机理提供理论依据。(本文来源于《天津科技大学》期刊2017-05-01）
罗伟锋[6]（2017）在《利用TALEN技术定点突变水稻DST基因》一文中研究指出水稻的耐盐碱性质一直是各大育种科学家们研究的重点之一。本研究利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)介导的基因组定点突变技术,以优良的粳稻品种空育131为改良对象,通过失活该材料DST基因,增强其耐盐碱性质。具体结果如下:1、成功构建了具有基因组定点突变功能的TALEN载体。2、通过农杆菌介导转化的方法,对水稻DST基因靶位点进行定点突变。通过对转基因位点PCR检测、Southern印记杂交分析;对DST基因靶位点的尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序分析,共获得2株DST基因靶位点片段缺失的阳性T_0代转基因植株,阳性转化率为1.16%。3、阳性转基因植株加代纯合后,对T_2代植株进行盐碱胁迫,通过表型分析,以及生理生化指标的测定,发现阳性转基因植株的盐碱耐受性确实比野生型对照植株高,也就是产生了耐盐碱性质。4、大田种植,调查T_2代植株与对照植株的农艺性状差异,结果表明,除了耐盐碱性质显着增强外,T_2代植株的各个农艺性状均未发生变化。(本文来源于《黑龙江大学》期刊2017-03-10）
何晓敏,杨运煌,刘买利,李芳[7]（2016）在《利用定点突变技术调节蛋白在液晶相中的排列》一文中研究指出在水溶液中,分子做各向同性的快速运动,自旋核间的偶极耦合作用被平均为零;而在液晶相中,分子的快速运动为各向异性,从而分子呈现定向排列,自旋核间的偶极耦合作用不能完全抵消,导致了残留的部分偶极耦合作用,称为残余偶极偶合作用(RDC)。与NOE、二面角和J耦合常数等结构约束不同,RDC能够提供长程、全局的结构信息,例如不同结构域或二级结构区之间的相对空间取向,因此为蛋白质溶液结构的精确解析提供了一种新的(本文来源于《第十九届全国波谱学学术会议论文摘要集》期刊2016-08-17）
李沛华,郭雪睿,彭继燕,陈惠,唐自钟[8]（2016）在《定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性》一文中研究指出β-葡萄糖苷酶(Bgl)是纤维素水解过程中的限速关键酶。提高Bgl的酶活,对于增强纤维素酶水解力有着十分重要的作用。本研究根据3D同源模建及分子对接,预测分析活性中心,利用定点突变做出针对性的改造。对来源于米曲霉的β-葡萄糖苷酶基因进行六个位点的定点突变,并将其在大肠杆菌中进行了突变基因的高效表达。经IPTG诱导后,分离纯化并进行酶学性质分析,获得酶活力提高的两个突变位点(Asn~(347)Ser,Gly~(235)Met),结果表明N~(347)S和G~(235)M位点的突变使酶的比活力显着提高,比原始酶活分别提高了43.1%和14.7%。这一研究为进一步提高β-葡萄糖苷酶活性研究提供一定的理论依据。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2016年08期）
姜明君,常振仪,卢嘉威,刘东风,谢刚[9]（2016）在《应用TALEN技术定点突变水稻苯达松抗性基因CYP81A6》一文中研究指出基因打靶技术可以定向改变细胞或生物遗传信息,正逐步成为功能基因组学研究的重要分子生物学手段。其中,类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术已在多个农作物中实现基因的定点修饰,其已成为作物分子育种一种有效的技术手段。本研究利用TALEN技术,将水稻(Oryza sativa)基因组中已知的苯达松(bentazone)抗性基因CYP81A6进行定点突变,以创制苯达松敏感突变体育种材料。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化粳稻品种武运粳7号(Oryza sativa subsp.japonica‘Wuyunjing 7’)愈伤,共获得110株T0水稻阳性转化苗,利用改良的PCR模板快速制备方法并结合高分辨率溶解曲线(high resolution melting,HRM)检测技术筛选T0代阳性植株,获得3株CYP81A6基因突变体材料,定点突变效率约为2.73%。基因测序分析及田间测试结果表明3株材料存在不同形式的基因序列变异,且均为嵌合体材料。对T1代群体继续进行苯达松敏感测试,发现该群体仍会出现大量的苯达松敏感植株,但未能筛选到纯合突变体。本研究虽未能获得稳定遗传的苯达松敏感基因纯合水稻突变体材料,但为下一步优化试验方案及继续筛选突变体积累了丰富的经验。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2016年08期）
吴蕊[10]（2016）在《利用计算机辅助设计和定点突变技术初步研究风车棕榈树过氧化物酶（WPTP）N-糖基化位点的功能》一文中研究指出棕榈树过氧化物酶稳定性极高,目前在食品工业上的应用越来越多。学术界对这类过氧化物酶研究逐渐增多,但是关于风车棕榈树过氧化物酶(WPTP)的研究成果极少。本文为过氧化物酶WPTP基础性研究,重点研究了 WPTP中13个糖基化位点中的2个位点对酶特性的影响。将野生型WPTP基因优化后转入巴斯德毕赤酵母GS115中,对其进行诱导表达;再对野生型WPTP进行定点突变,即分别在WPTP基因序列的60位和144位,将天门冬酰胺(Asn,N)突变为谷氨酰胺(Gln,Q),再次转入毕赤酵母诱导表达。用MALDI-TOFMS鉴定得到的叁种纯化蛋白,再进行酶活、底物特异性比较,以确定本实验研究的两糖基化位点与酶功能性质的关系。最后用同源模拟的方法,分别得出以上叁个酶的叁维结构模型;再将它们与底物小分子分别进行分子对接模拟,以可视化的角度研究分析两突变对酶与小分子对接的影响。取得成果如下:1.首次将野生型WPTP基因、N60Q-WPTP基因和N144-WPTP基因转入巴斯德毕赤酵母,成功得到叁株重组菌:GS115/pPICZαA-WT-WPTPY、GS115/pPICZαA-N60Q-WPTPY、GS115/pPICZαA-N144Q-WPTPY,并成功诱导表达出野生型和两种突变型酶,纯化后用SDS-PAGE以及MALDI-TOFMS鉴定,结果准确。2.以TMB为底物时,测得的N60Q-WPTP活性比野生型WPTP减少了 50%左右,N144Q与野生型相比活性减少将近80%,这说明N60和N144两个糖基化位点对WPTP的酶活性相当重要。野生型WPTP的N60和N144位均有糖链相连,失去糖链后,酶活性降低严重。3.用同源建模的方法首次得到WPTP分子的叁维结构模型。模型显示N60位点和N144位点均在Heme活性口袋附近的位置,且N144位更近。4.结合实验结果与模拟结果可知,离活性位点更近的N144位点上所连接的糖链对底物与酶结合时起到了更大的助力作用。底物虽然不需要直接结合到血红素疏水中心,但是底物小分子还是需要通过酶分子活性口袋周围的氨基酸残基,向血红素辅基进行远程电子传递的,这时的糖链相当于酶分子展露在外的触手,帮助底物分子接近活性口袋,以更快的速度完成电子传递。本研究是棕榈树过氧化物酶的结构与功能关系的一大进展,为以后过氧化物酶分子糖基化位点作用研究提供了启示作用。(本文来源于《海南大学》期刊2016-05-01）
定点突变技术论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因特定位点突变的大鼠模型。方法:根据FARS2基因序列,设计FARS2基因特异性的单链向导RNA(sgRNA)引物序列并克隆入p U57-T7-GDNA载体。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA。将体外转录的sgRNA/Cas9 mRNA显微注射入SD大鼠受精卵,通过PCR和基因测序对FARS2基因特定位点突变进行检测和鉴定。繁育FARS2基因敲除大鼠并分析后代突变情况。结果:基因测序证实成功构建表达sgRNA载体,成功将sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入大鼠受精卵。基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠。DNA测序结果证实5号大鼠(ID#5)发生了gac> tac突变,该突变并可遗传至子代大鼠。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功制备FARS2基因定点突变的大鼠模型,为进一步研究FARS2的功能奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
定点突变技术论文参考文献
[1].刘华清,孙庆山,杨绍华,周淑芬,王锋.利用基因组编辑技术定点突变IPA1基因创制水稻新株型材料[J].福建农业学报.2019
[2].李晨浩,车凤玉,王国霞,杨行,李辉.利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因定点突变的大鼠模型[J].神经解剖学杂志.2018
[3].徐旋.柑橘原生质体瞬时转化体系优化及利用CRISPR/Cas9技术定点突变山金柑基因[D].华中农业大学.2018
[4].金梦迪.利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因[D].厦门大学.2018
[5].王惠.利用定点突变技术改变耐盐木聚糖酶Xyn22酶活性和耐盐特性的研究[D].天津科技大学.2017
[6].罗伟锋.利用TALEN技术定点突变水稻DST基因[D].黑龙江大学.2017
[7].何晓敏,杨运煌,刘买利,李芳.利用定点突变技术调节蛋白在液晶相中的排列[C].第十九届全国波谱学学术会议论文摘要集.2016
[8].李沛华,郭雪睿,彭继燕,陈惠,唐自钟.定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性[J].基因组学与应用生物学.2016
[9].姜明君,常振仪,卢嘉威,刘东风,谢刚.应用TALEN技术定点突变水稻苯达松抗性基因CYP81A6[J].农业生物技术学报.2016
[10].吴蕊.利用计算机辅助设计和定点突变技术初步研究风车棕榈树过氧化物酶（WPTP）N-糖基化位点的功能[D].海南大学.2016