一、Using laser confocal scanning microscope to study ischemia-hypoxia injury in rat brain slice（论文文献综述）
戚远通[1]（2021）在《多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒靶向治疗心脏病的研究》文中进行了进一步梳理心脏病是影响人类健康的主要疾病之一,其具有高发病率和致死率的特点。目前药物疗法因使用方便,依从性好被认为最具前景的治疗方式,但同时也面临诸多困难,如常规治疗药物保留时间短,心脏组织分布低,治疗效果不佳。且心脏局部注射和经心包、冠状动脉注射等给药方式因侵入性、分布难以控制、可重复性差而应用受限。因此,构建靶向性好、依从性强、使用简单的新型制剂对于心脏病的治疗意义重大。随着纳米技术与药学学科的加速融合,新型纳米递送系统的涌现为心脏药物递送提供了新的策略,但同时也面临着诸多困难,如在递送效率、质量控制、制造再现性和可扩展性等方面存在的问题使得心脏靶向纳米疗法的工程设计仍面临重大挑战,构建优良的工程化纳米药物制备体系意义重大。多酚化合物被证明对心肌细胞和组织具有高度亲和力,且多酚羟基被证实与含羰基材料能够通过氢键作用稳定结合。因此本课题设计通过多酚化合物辅助的纳米沉淀/自组装方法,期望构建心脏靶向药物的工程化纳米制备平台,通过参数得到系列纳米粒,系统表征其粒径、形态和稳定性。同时在体内外心肌损伤模型中验证基于该平台筛选的生物活性纳米粒经静脉注射后的心脏靶向能力和治疗心脏病作用。方法1.活性氧（ROS）响应性材料OCD和ROS清除性材料TPCD的合成及表征4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）与β环糊精（β-CD）键合得到氧化响应性材料OCD。将Tempol（Tpl）与PBAP先后键合到β-CD得到ROS清除性材料TPCD。利用红外光谱、核磁氢谱和质谱分析产物结构。2材料体外清除ROS能力评价通过DPPH·清除实验来考察多酚化合物和载体材料清除自由基的能力;利用相应试剂盒测定材料对超氧阴离子和过氧化氢的清除能力。3.基于多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒的构建以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、OCD和TPCD作为代表性的载体材料,没食子酸（GA）,儿茶素（CAT）,表没食子儿茶素没食子酸酯（EG）和鞣酸（TA）作为具有不同数量酚羟基的典型多酚化合物,通过改变载体/多酚化合物质量比、多酚化合物种类和有机溶剂类型得到系列纳米粒。系统表征并评价其在不同介质中稳定性。利用银沉淀实验、BCA定量实验、红外光谱、X射线光电子能谱（XPS）和不同介质中粒径变化,确认纳米粒表面的多酚修饰及其形成初步机制。4.生物活性纳米粒响应性水解及ROS清除能力评价将纳米粒与不同浓度H2O2共孵育,通过观察纳米粒形貌和测定溶液吸光度,评价纳米粒响应性水解能力。并分别利用相应试剂盒测定纳米粒对羟基自由基、超氧阴离子、过氧化氢的清除能力。5心肌细胞对生物活性纳米粒吞噬能力评价将不同浓度Cy5荧光标记的TPCD-TA纳米粒（TPTN）与正常或损伤大鼠H9C2心肌细胞孵育不同时间,利用激光共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术探究心肌细胞对生物活性纳米粒的吞噬能力。6.生物活性纳米粒细胞水平抗氧化、抗炎效应评价分别利用Co Cl2诱导大鼠心肌细胞缺氧/缺血损伤模型,异丙肾上腺素（ISO）诱导大鼠心肌细胞肥大模型。CLSM和流式细胞术分析TPTN对细胞内ROS水平影响,测定细胞内H2O2和丙二醛（MDA）以及培养上清液中的肿瘤坏死因子（TNF）-α和心肌肌钙蛋白（c Tn）-I的水平。7.生物活性纳米粒在心脏骤停复苏后大鼠和心肌肥大小鼠心脏靶向性研究经食道电刺激诱发VF,建立大鼠心脏骤停复苏后心肌损伤模型;通过异丙肾上腺素皮下注射诱导小鼠心肌肥大模型。利用活体成像仪分析模型鼠不同时间血和心脏Cy7.5/TPTN荧光强度。另外利用CLSM观察心脏冰冻切片中Cy5/TPTN分布。8.生物活性纳米粒对心脏骤停后复苏大鼠治疗作用评价监测TPTN对心脏骤停复苏后心肌损伤模型大鼠MAP、心功能和心电图影响,对大鼠进行神经功能评分和生存状态评价。通过心肌切片评估心肌损伤和心肌纤维化。另外,检测心脏H2O2、MDA、TNF-α和白介素（IL）-6的水平以及血清中的c Tn-I和肌酸激酶（CK）。9.生物活性纳米粒对心肌肥大小鼠治疗作用评价使用超声心动图评估TPTN治疗对心肌肥大小鼠心室壁厚度和心功能影响。观察心脏大小,测定心脏指数。通过心脏切片染色观察组织纤维化程度。另外,分别测量心脏中H2O2,MDA,TNF-α和IL-6的水平以及血清c Tn-I,脑钠肽（BNP）水平。10.生物活性纳米粒初步安全性评价通过CCK-8细胞毒性试验、溶血试验和心肌肥大小鼠在不同治疗剂量TPTN作用下体重变化、脏器指数、血常规以及肝肾功变化,评价纳米粒体内外安全性。结果1.一个β-CD分子键合约5个PBAP得到氧化响应性材料OCD。一个β-CD分子键合约2个Tpl和5个PBAP得到材料TPCD。2.基于多酚化合物表面自组装构建出系列生物活性纳米粒,纳米粒在去离子水、PBS或胎牛血清等介质中均具有良好的稳定性。通过银沉积法、BCA定量分析、XPS和FT-IR证实了纳米粒上TA的修饰。同时XPS、FT-IR和不同介质中粒径变化证明载体材料和多酚化合物通过氢键作用稳定结合。3.体外ROS清除实验证实,基于多酚化合物表面自组装构建的纳米粒具有良好的ROS清除能力,其中OCD-TA和TPCD-TA纳米粒显示出ROS响应性水解能力。4.体外生物活性评价表明,基于多酚化合物表面自组装构建的活性纳米粒TPTN可被正常和损伤心肌细胞有效吞噬,从而在Co Cl2刺激制备的缺氧缺血性损伤的细胞模型和ISO诱导的心肌细胞肥大模型中抑制氧化应激,减弱炎症反应,从而发挥心肌细胞保护作用。5.心脏靶向性实验发现,Cy7.5/TPTN在心脏骤停复苏后心肌损伤大鼠和心肌肥大小鼠心脏荧光强度明显高于健康鼠,且模型鼠离体心脏的荧光强度存在蓄积现象。在心脏冰冻切片中观察到Cy5/TPTN荧光在心肌区域的明显分布。这些结果证实TPTN纳米粒通过静脉注射给药具有明显的心脏靶向性。6.在心脏骤停复苏后心肌损伤大鼠靶向治疗实验中,TPTN可显着提高模型大鼠存活率,提高动脉血压和左心室射血分数,改善心电状态和神经功能,降低心肌组织中氧化介质、促炎性细胞因子和血清心肌损伤因子的表达水平。心肌组织切片证实TPTN可改善心肌细胞损伤和胶原蛋白沉积。7.在心肌肥大小鼠治疗实验中,TPTN可减少心室扩张,改善射血分数,降低心脏指数、心脏中氧化介质、促炎性细胞因子以及心肌损伤血清标志物c Tn-I和BNP的水平,有效抑制模型小鼠心肌纤维化。8.TPTN不影响细胞活力,不会发生溶血现象。在心肌肥大小鼠的治疗过程中,未观察到明显的体重减轻或行为异常变化,主要器官的器官指数和肝肾功与对照小鼠相比无明显差异。结论1.基于多酚化合物表面自组装,构建出心脏靶向的生物活性纳米粒制备平台,通过改变载体材料/多酚化合物的重量比、多酚化合物类型和有机相等参数,可制备具有所需理化性质的纳米粒,经系统表征表明其粒径均一,形态饱满,状态稳定。2.经心脏靶向的工程化纳米制备平台筛选的多酚化合物表面自组装纳米粒TPTN,具有稳定的理化性质、良好的ROS响应性和强大的ROS清除能力。TPTN在细胞水平可被大鼠心肌细胞有效吞噬后保护细胞免受Co Cl2诱导的缺氧缺血性损伤和ISO刺激的心肌肥大损伤。3.活体成像和激光共聚焦观察表明负载荧光的TPTN经静脉注射可靶向富集在心肌损伤部位。在体内心肌损伤动物模型中证明其显着减轻氧化应激,抑制炎症反应从而减少心肌损伤,有效改善心肌功能障碍。4.初步的体内外安全性实验证实了多酚化合物表面自组装纳米粒TPTN的良好安全性。
陈莎[2]（2021）在《β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究》文中研究指明急性缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一,具有发病率高、致死率高、致残率高和复发率高的特点,但迄今为止,其病理生理机制还尚不完全清楚,还未找到其治疗行之有效的方法。因此,深入阐明急性缺血性脑卒中的发病机制,寻找治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物具有很高的经济意义和社会价值。大量研究表明脑缺血后细胞间隙谷氨酸过量释放引起兴奋性毒性在脑缺血刺激后神经元细胞死亡过程中起着非常的作用。过量释放的谷氨酸主要激活两种突触后膜受体,NMDARs和AMPARs。AMPARs亚基Glu A2抑制钙离子通透,决定了AMPARs对钙离子通透性,依据AMPARs是否含有Glu A2,将AMPARs分为CI-AMPARs和CP-AMPARs。脑缺血损伤后,大量钙离子经过通透性已改变的AMPARs进入相对脆弱的海马CA1区锥体神经元,使胞内钙超载,引发神经元细胞发生致死性反应。另外,AMPARs介导了中枢神经系统（CNS）绝大多数快兴奋性突触传递,在学习记忆和认知等方面具有重要作用。研究发现脑缺血后神经元细胞内钙离子内流增加还加剧了脑缺血后神经退行性病变进程。长时程增强（long term potentiation,LTP）和长时程抑制（long term depression,LTD）调控的突触可塑性被认为是学习和记忆的生理基础。近期文献报道,CI-AMPARs从突触外和/或细胞内向海马突触膜表面转运募集,因而改变钙离子流,影响突触胞膜上电流变化,调控LTP和LTD过程进而影响认知相关的学习记忆过程。但目前,CI-AMPARs在急性缺血性脑卒中后认知障碍中是否发挥作用还不清楚。内源性大麻系统最早被发现在调节神经行为功能中发挥重要作用,如成瘾,焦虑,摄食等,后来研究发现大麻系统在脑缺血再灌注和一些神经退行性疾病的病理生理机制中发挥重要作用。本课题组在前期工作中筛选到一与大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid receptor type 2,CB2）结合的CB2受体完全激动剂β-石竹烯（β-Caryophyllene,BCP）,初步发现其具有保护神经损伤和提高脑缺血动物的学习记忆能力,但其具体发挥作用的明确机制不详。鉴于有CB2受体激动剂可以调节啮齿类动物内侧前额叶皮质锥体神经元中Ca2+流,即CB2受体可能调节离子稳态和神经元兴奋性的文献报道,为此,我们推测CB2受体β-石竹烯（BCP）具有的保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用可能与其调节与钙离子通透性相关的CI-AMPARs膜转运相关。基于这一科学假说,我们以小鼠神经元细胞糖氧剥夺复氧模型OGD/R及小鼠急性缺血性脑卒中模型MCAO为研究对象,通过MTT增殖实验、流式凋亡检测、细胞形态学观察、神经行为学评分、转棒实验、TTC染色、H&E染色、MWM水迷宫、物体辨别实验、免疫荧光双标、流式检测钙离子流、膜片钳电生理技术等实验,并初步分析临床急性脑梗病人临床样本与临床资料,从细胞、动物和临床标本水平,在验证与分析CB2受体β-石竹烯（BCP）具有保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用基础之上,研究了BCP调节CI-AMPARs膜转运与保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的关系,并探讨了BCP调节CI-AMPARs膜转运的分子机制。研究方法与结果:1.β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）以小鼠神经元细胞HT-22为研究对象,建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,分组:Control组、Control+10μM BCP组（正常对照组）、OGD/R+5μM BCP组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+20μM BCP组,作用时间24h、48h及72h,运用MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,从细胞水平验证与分析,BCP对OGD/R模型作用的剂量依赖及时间依赖关系,实验结果在细胞水平明确BCP对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）具有保护作用。（2）（1）选用C57BL/6,雄性,6～8周龄小鼠,随机分为假手术组（sham组）、sham+BCP 72mg/kg组（正常对照组）、模型+溶剂组、模型+BCP 36mg/kg治疗组、模型+BCP 72mg/kg治疗组和模型+144mg/kg治疗组,每组6只C57BL/6小鼠,连续灌胃给药6天,第6天采用大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立急性缺血性脑卒中模型。（2）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分（Modified Neurological Severity Score:m NSS）和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测各组小鼠脑梗死体积,苏木精-伊红（H&E）染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,从动物水平验证与分析BCP具有保护急性缺血性脑卒中小鼠的作用,结果发现BCP有明显剂量依赖性保护急性缺血性脑卒中小鼠模型脑神经损伤的作用。（3）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验的空间定位航行实验、空间探索实验检测逃避潜伏期、经过目标平台的次数及目标现象活动时间,物体识别实验（Object Recognition Task,ORT）检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,验证与分析BCP保护急性缺血性脑卒中后学习记忆障碍,结果发现BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的逃避潜伏期、经过目标平台的次数、目标现象活动时间及物体识别指数,即BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的认知功能障碍。2.β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运（1）运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中CI-AMPARs关键蛋白AMPARs亚基Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,结果发现BCP可以促进氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加。（2）运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现OGD/R细胞模型中,细胞内钙离子流增多,而BCP处理的OGD/R细胞,细胞钙离子内流减少,即BCP可以抑制氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中钙离子内流。（3）收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,制作冰冻切片,应用免疫荧光双染共定位方法（共染突触标志物Synaptophysin及Glu A2）检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,结果发现急性缺血性脑卒中模型MCAO中Glu A2在神经突触膜表面聚集减少,而BCP给药后可以增加MCAO后Glu A2在神经突触膜表面的聚集表达,该研究结果提示,BCP可以促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加。（4）应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现BCP给药后可以缓解急性缺血性脑卒中MCAO模型AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率增加影响LTP和LTD进程。3.β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）采用ELISA技术、Western Blot技术检测氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型、急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中及BCP给药后,与神经保护和学习记忆过程、CI-AMPARs转运密切相关的c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,发现BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（2）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22,分为Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加和抑制钙离子内流的作用,即BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜转运是PKA依赖形式的。（3）C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,免疫荧光双染共定位方法检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现,PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加,可以逆转BCP抑制MCAO模型中AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率,即BCP促进MCAO动物模型中CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程是PKA依赖形式的。（4）Western Blotting同时监测（2）和（3）的各组中c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,证实BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（5）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22分组:Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型发挥保护作用。（6）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。TTC染色检测各组小鼠脑梗死体积,H&E染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对MCAO动物模型神经功能损伤的保护作用。（7）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验、物体识别实验检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程改善急性缺血性脑卒中后认知学习记忆障碍。（8）收集30例临床急性缺血性脑卒中病人取栓治疗前后血清样本,ELISA法检测c AMP的浓度变化,结合病人临床病例资料分析统计c AMP的浓度变化与治疗前后缺血性脑卒中临床指征的关系,发现急性缺血性脑卒中病人取栓后c AMP浓度上调。研究结果表明:（1）明确了BCP具有保护急性缺血性脑卒中神经损伤及卒中后认知功能障碍的作用;（2）首次发现BCP具有促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运的作用;（3）发现BCP可通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运抑制神经元细胞钙离子内流,调节神经突触可塑性发挥保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用。本研究结果为进一步阐明BCP在保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用和分子机制奠定基础,为寻找急性缺血性脑卒中治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物提供了新思路。
兰俊英[3]（2021）在《δ-catenin相关的GluR2内化在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究》文中认为新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是新生儿脑组织损伤的常见原因之一,具有较高的发病率和死亡率,可导致多种严重的神经系统后遗症。目前临床仍缺乏治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的有效措施。因此,进一步阐明HIBD的病理生理机制,对寻找新的治疗靶点,提高HIBD的治愈率,改善患者的预后十分重要。神经元兴奋性毒性是缺氧缺血性脑损伤的重要病理机制。正常情况下,机体内谷氨酸的释放、摄取和重吸收保持相对平衡的状态。当脑部发生缺氧缺血时,脑组织供能不足引起谷氨酸的释放和重吸收失衡,细胞膜上的谷氨酸受体过度激活,细胞外大量钙离子流入神经元内,造成胞内钙超载,进而启动神经元的坏死和凋亡过程。AMPA受体是参与细胞兴奋性毒性的主要谷氨酸促离子型受体之一,其结构为GluR1-GluR4四种亚基构成的四异聚体。其对钙离子的通透性主要取决于其组成结构中是否含有GluR2亚基:当AMPA受体结构中含有GluR2亚基时,为钙不通透型AMPA受体;当AMPA受体结构中不含GluR2亚基,则为钙通透型AMPA受体。当缺血缺氧发生时,细胞膜上的钙不通透型AMPA受体可转化为钙通透型AMPA受体,大量钙离子内流,引发下游神经毒性级联反应。δ-连环蛋白（δ-catenin）是p120连环蛋白超家族成员之一,主要表达于健康个体的脑组织中。δ-catenin连接钙黏蛋白和肌动蛋白骨架,在神经元发育以及突触的形成中具有重要作用。越来越多的研究表明,δ-catenin在多种肿瘤组织中也有较高的表达水平,是促进肿瘤细胞生存和增殖的重要因素。但在缺氧缺血脑损伤中,δ-catenin是否影响神经元的损伤以及预后尚未见报道。目的:本研究利用C57BL/6J小鼠（出生后10天）制备HIBD模型,观察δ-catenin在HIBD后对脑组织神经元损伤和死亡的影响,并探讨这种影响是否与AMPA受体GluR2内化有关。方法:1.动物模型制备:取出生10天的C57BL/6J新生小鼠进行左侧颈动脉结扎并缺氧（7.5%O2+92.5%N2）1.5h,制备HIBD模型。2.分组（1）假手术（sham）组;HIBD模型组（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h）。（2）假手术（sham）组,HIBD组,HIBD+si-δ-catenin（HIBD+si-δ-cat）组,HIBD+阴性对照（HIBD+NC）组3.检测指标（1）免疫印迹法检测目的蛋白的表达水平。（2）TTC染色检测小鼠脑组织梗死面积。（3）尼氏染色检测脑组织中神经元的状态。（4）TUNEL检测脑组织神经元凋亡情况。（5）免疫组织荧光及激光共聚焦检测脑组织目的蛋白的表达、GluR2的亚细胞分布情况及GluR2与GRIP1的共定位情况。（6）免疫共沉淀检测GluR2与GRIP1的相互作用。结果:1.缺氧缺血12 h、24 h和48 h后,患侧脑组织中δ-catenin的表达水平明显降低。2.si RNA干扰δ-catenin表达后,缺氧缺血导致的脑组织的梗死面积和神经元的凋亡数量进一步增加,患侧脑组织凋亡蛋白的表达也进一步增加,抗凋亡蛋白的水平进一步降低。3.缺氧缺血后,神经元细胞膜上GluR2表达明显下调,且与δ-catenin水平下调的时间点相吻合。4.si RNA干扰δ-catenin表达后,缺血缺氧所致的神经元胞膜上的GluR2进一步内化。5.si RNA干扰δ-catenin表达后,缺血缺氧后神经元中GluR2与GRIP1的相互作用进一步减少。结论:在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤模型中,δ-catenin的表达减少导致脑组织损伤。其可能的机制是通过下调δ-catenin的表达,减少了δ-catenin、GRIP1与GluR2的结合,引起神经元细胞膜上GluR2的内化,钙通透型AMPA受体增加,随后出现细胞内钙超载,导致大量神经元死亡。
张芳[4]（2020）在《3巯基丙酮酸硫转移酶产生的硫化氢对缺血缺氧性损伤的脑血管内皮细胞保护作用及机制探讨》文中进行了进一步梳理背景在全球范围内,每年约有550万人死于缺血性或出血性中风,中风是继缺血性心脏病之后第二大最常见的死亡原因,其特点为患病率高、死亡率高、复发率高及致残率高。目前溶栓药物治疗也被认为临床治疗急性中风关键环节,但是及时恢复缺血区血流供应又会引发更为严重的脑组织结构和功能损伤,又称为缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion,I/R）。内皮细胞（endothelial cell,EC）是血管的第一道屏障,内皮功能受损加重缺血性脑损伤。线粒体是细胞中高度活跃的细胞器,内皮细胞线粒体功能障碍最近被认为是I/R损伤后继发细胞死亡的新机制。脑血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）和线粒体对缺血缺氧非常敏感,改善线粒体功能已被证明是改善心脑血管疾病的潜在干预措施。3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）主要定位于线粒体,是内源性（hydrogen sulfide,H2S）合成酶之一,是大脑中H2S产生的主要来源。3-MST/H2S具有多种功能,包括血管生成,血管舒张,抗氧化应激和促进生物能作用,但是对其在脑缺血损伤发挥的作用知之甚少。Rho激酶信号途径是心脑血管系统的重要靶点,ROCK是Rho A最重要、最直接的效应分子。Rho A/ROCK途径与内皮细胞功能关系已有许多研究,其激活可能损害线粒体动力学和能量学。因此,我们猜测内皮细胞线粒体3-MST产生的H2S通过抑制Rho A/ROCK信号通路而产生脑缺血和再灌注损伤保护作用,并通过体内体外实验探讨其角色和潜在机制。目的:1.细胞水平探讨3-MST生成的H2S对缺血缺氧损伤的脑血管内皮细胞和线粒体的保护作用及其相应Rho A/ROCK通路机制;2.动物水平探讨3-MST生成的H2S对CSE-/-小鼠缺血再灌注损伤的保护作用及其相应Rho A/ROCK通路机制。3.人体脑血管中动脉远端血管标本观察脑缺血后内皮损伤情况以及血管3-MST和H2S水平的变化。方法:1.大鼠原代脑血管内皮细胞培养,进行形态学和免疫荧光鉴定。建立氧糖剥夺再灌注损伤（oxygen and glucose deprivation,OGD/R）细胞模型,加入不同浓度3-巯基丙酮酸（mercaptopyruvate,3-MP）和L-天冬氨酸（L-aspartic acid,L-Asp）后MTT法检测琥珀酸脱氢酶活力变化。1.1实验分为五组,分别是:（1）Control组;（2）OGD/R组;（3）L-Asp（10μM）组;（4）3-MP（90 n M）组;（5）3-MP+L-Asp组。（3-5组在缺氧和复氧过程均加入相应药物）1.2实验结束后采用亚甲基蓝法和Western blot法分别检测细胞H2S含量和3-MST蛋白表达变化。采用活性氧（reactive oxygen species,ROS）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的水平变化来评估内皮细胞损伤。1.3原代内皮细胞用免疫荧光法检测3-MST以及Rho A,ROCK1和ROCK2线粒体定位,同时差速离心法分离获得纯化线粒体,用Western blot法再次进行上述蛋白线粒体定位的鉴定。1.4实验结束后用荧光染料7-叠氮基-4-甲基香豆素（Az MC）检测线粒体H2S含量变化,Western blot法检测线粒体3-MST和ATP5D蛋白表达变化。同时检测以下线粒体功能损伤相关指标:透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）观察线粒体超微结构变化;Mito SOX荧光探针检测线粒体活性氧水平;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测线粒体ATP合酶活性;化学发光法检测线粒体ATP含量;JC-1染料法检测线粒体膜电位变化。1.5实验结束,对纯化的线粒体除外细胞裂解液和线粒体采用ELISA法检测Rho A活力,Western blot法检测ROCK1和ROCK2表达水平。2.采用大脑中动脉线栓栓塞和拔除法建立局灶性脑缺血再灌注模型（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）,实验结束后采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法和Zea Longa神经功能评分法检测脑缺血损伤情况。2.1采用激光散斑血流成像（laser speckle flowgraphy,LSFG）技术检测各组小鼠手术前,栓塞后,拔出线栓再灌注颈总动脉给药后10 min,1 h和22 h的脑血流量（cerebral blood flow,CBF）。2.2实验结束后,采用苏木素-伊红（HE）染色法检测脑中动脉血管内皮形态学变化,并检测血管H2S水平变化。免疫组化法检测中动脉血管Rho A,ROCK1和ROCK2蛋白表达变化。3.收集大面积脑梗死患者（massive cerebral infarction,MCI）和脑内深部良性肿瘤患者正常部位的大脑中动脉远端皮层脑血管;HE染色和TEM观察脑血管内皮的形态学变化;亚甲基蓝法检测H2S含量的变化;免疫荧光法（IF）和Western blot检测血管组织中3-MST蛋白的表达。结果:1.与对照组相比,内皮细胞OGD（4h）-R（20 h）损伤模型中,内皮细胞琥珀酸脱氢酶活力显着降低（P<0.01）,3-MP（10,30,90 n M）预处理能够浓度梯度增加琥珀酸脱氢酶活力（P<0.01）,L-Asp（1μM及以上）预孵进一步加重OGD/R导致的细胞损伤（P<0.05;P<0.01）,3-MP（90 n M）增加的细胞活力能够被0.3μM及以上L-Asp显着抑制。Az MC探针和亚甲基蓝法检测结果显示,OGD/R损伤后内皮细胞H2S含量明显下降,L-Asp（10μM）预孵进一步抑制细胞H2S产生（P<0.05）,3-MP（90 n M）预孵能够显着增加细胞H2S含量,3-MP的这种作用能够被L-Asp明显抑制。同样,与L-Asp作用相反,3-MP预孵能够显着增加OGD/R导致的3-MST的表达的下降。2.与对照组相比,内皮细胞OGD/R损伤后,细胞发生氧化应激损伤和能量代谢障碍,表现为显着升高的ROS水平,降低的T-AOC水平,同时ATP含量下降（P<0.01）。荧光探针和流式细胞术证实3-MP预孵能够显着抑制细胞ROS水平,提升T-AOC和ATP水平,而L-Asp预处理表现出相反的作用。3.免疫荧光和Western blot实验结果显示3-MST不仅定位于内皮细胞胞浆,而且定位于线粒体。与对照组相比,Az MC探针检测到线粒体H2S荧光在OGD/R损伤后明显下降。与模型组相比,L-Asp预孵进一步降低线粒体H2S荧光,而3-MP预孵能够逆转线粒体H2S荧光的衰退。对纯化的线粒体进行免疫印迹检测,结果显示与对照组相比,OGD/R损伤后线粒体3-MST表达下降（P<0.01）;与模型组相比,3-MP预孵能够增加线粒体3-MST表达（P<0.01）,3-MP的这种作用能够被L-Asp预处理减弱。4.与对照组相比,内皮细胞线粒体OGD/R损伤后,线粒体发生功能障碍,主要表现为超微结构的破坏,线粒体ROS的增加（P<0.01）,线粒体ATP合酶活性下降（P<0.01）及其重要亚基ATP5D表达显着抑制,导致ATP产生减少（P<0.01）,与此同时,线粒体膜电位显着下降。与L-Asp作用相反,3-MP预孵能显着逆转线粒体功能损伤的这些指标,差异具有统计学意义。5.与对照组相比,OGD/R损伤后,线粒体除外细胞裂解液和线粒体中Rho A活性、ROCK1和ROCK2表达显着增加,L-Asp预处理略微增加Rho A活性、ROCK1和ROCK2表达,尤其在线粒体外细胞裂解液中ROCK2表达显着增加（P<0.05）。与模型组相比,3-MP预处理能明显抑制各组Rho A活性、ROCK1和ROCK2表达（P<0.01）。6.CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后,TTC染色梗死区和神经功能评分显着增加,提示模型建立成功。LSI结果显示模型组脑CBF明显下降（P<0.01）,颈总动脉L-Asp再灌注给药对脑CBF有一定抑制作用（P<0.05）。但3-MP预处理能增加再灌注22 h后的脑CBF（P<0.05）。HE染色结果显示,与假手术组相比,模型组小鼠脑中动脉内皮形态结构明显受损,3-MP颈总动脉预处理组内皮结构相对完整,细胞排列整齐。7.亚甲基蓝实验结果显示,CSE-/-小鼠经MCAO/R损伤后,血管中动脉H2S含量显着下降,与L-Asp作用相反,3-MP显着提升血管组织H2S含量。免疫组织化学结果显示,缺血再灌注损伤后,CSE-/-小鼠脑血管内皮Rho A,ROCK1和ROCK2组织化学染色深度显着增加,与L-Asp处理作用相反,3-MP预处理显着减少其染色深度。8.与非缺血组相比,MCI患者大脑中动脉血管内皮和线粒体形态结构发生损伤性改变,表现为内皮结构破损,EC胞膜破损,核染色质边集,线粒体肿胀,出现嵴的断裂、消失甚至空泡化。同时,MCI患者血管H2S含量明显下降（P<0.05）,3-MST蛋白表达显着下调（P<0.01）。结论:1.在大鼠脑血管内皮细胞缺氧复氧性损伤中,3-MST产生的H2S发生了明显的减少。2.3-MST产生的H2S对体外缺氧复氧性损伤内皮细胞具有保护作用,与抑制线粒体氧化应激和促进能量代谢有关。3.3-MST产生的H2S对内皮细胞缺氧复氧性损伤的保护作用,与抑制细胞和线粒体Rho A/ROCK信号通路有关。4.3-MST产生的H2S对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,此作用与抑制内皮Rho A/ROCK信号通路保护内皮增加血流量有关。5.人体标本提示脑中动脉3-MST、H2S的下调与缺血性中风相关。
栾朋伟[5]（2020）在《丹参多酚酸盐通过调控小胶质细胞对神经元损伤保护作用的研究》文中进行了进一步梳理目的在急性脑缺血再灌注损伤发生后,不仅会引起脑内神经元发生损伤,而且会引起小胶质细胞发生极化引起炎症反应,释放炎症因子促进神经元细胞的进一步发生损伤,从而加重脑损伤。所以在本课题中主要通过体外缺氧缺糖（OGD）神经元细胞损伤和缺氧缺糖诱导小胶质细胞极化两个方面探讨丹参多酚酸盐的神经保护机制,并结合大脑中动脉阻塞模型（MCAO）,验证丹参多酚酸盐（salvia）的治疗效果。方法1.在OGD诱导神经元细胞损伤模型中:首先,OGD不同时间（2h、4h、8h）作用于神经元细胞筛选出最佳缺氧时间。接下来,采用细胞计数方法（CCK-8）测定salvia神经保护的最佳浓度;OGD损伤神经元细胞后,采用激光共聚焦成像技术（CLSM）测定salvia对活性氧簇（ROS）的荧光表达影响。最后,通过Hoechst 33342染色和流式细胞术方法测定了 salvia对神经元细胞核损伤和凋亡的保护作用;同时使用蛋白质印迹实验（Western Blotting）测定salvia作用后神经元细胞内凋亡信号通路（Caspase-3）的表达情况。2.在OGD诱导小胶质细胞极化模型中:首先,OGD不同时间（3h、6h、12 h、24h）作用于小胶质细胞筛选出最佳诱导表型极化时间。接下来,采用CCK-8实验测定salvia对小胶质细胞毒性作用;OGD可以诱导小胶质细胞发生氧化应激,采用CLSM实验方法测定不同浓度salvia对小胶质细胞内ROS和表型极化的荧光表达情况,并且测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的表达变化;采用Western Blotting检测salvia对小胶质细胞内炎症信号通路（TLR4）的表达情况,并使用采用逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ）的mRNA水平表达情况;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测炎症因子的蛋白表达水平。最后,采用流式细胞术和Western Blotting方法测定salvia抑制OGD诱导的小胶质细胞活化,从而影响小胶质细胞对神经元细胞的凋亡。3.在大鼠大脑中动脉阻塞模型（MCAO）中:首先,采用TTC染色实验方法测定不同浓度的salvia对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的影响。接下来,采用苏木精-伊红（HE）和尼氏（Nissl）染色方法测定salvia作用后的脑切片病理变化;采用激光散斑对比成像方法（LSCI）测定不同实验组中的大鼠脑血流变化情况;采用CLSM实验方法测定不同组小胶质细胞的表型转化情况;TUNEL染色实验检测salvia对于大鼠急性脑缺血再灌注损伤脑内细胞凋亡的影响;采用Western Blotting实验检测脑损伤组织中凋亡通路相关蛋白表达情况。最后,采用Morris水迷宫和Rota-Rod转棒实验测定salvia长期作用于急性脑缺血再灌注损伤后大鼠的认知能力和运动能力的改善情况。结果1.通过一系列实验方法成功构建了 OGD诱导神经元细胞损伤模型。然后使用salvia进行干预OGD诱导的神经元细胞损伤。结果表明:salvia（5μM）能够显着改善OGD诱导的神经元细胞损伤以及降低ROS的表达水平,同时减少损伤神经元细胞中LDH和NO的表达。并且salvia能够显着性减少损伤神经元细胞的凋亡率和抑制Caspase-3凋亡信号通路相关蛋白的表达水平。2.通过一系列实验方法成功构建了 OGD诱导小胶质细胞极化模型。实验结果表明:OGD能够诱导小胶质细胞发生氧化应激反应,导致大量ROS表达,使得小胶质细胞向促炎表型转变,炎症因子TNF-α和IL-6表达含量显着增加,IL-1β,IFN-γ的表达没有变化。接下来将salvia（4 μM,16 μM,64 μM）和小胶质细胞在OGD条件下共孵育,随着salvia浓度的增加,OGD诱导小胶质细胞中ROS的表达含量逐渐减少,并且抗氧化酶SOD,CAT,GHS-px的表达含量也逐渐降低。然后采用荧光染色观察小胶质细胞的表型,salvia与小胶质细胞共孵育后,促炎表型抗体CD86的表达含量逐渐降低。Salvia可降低OGD诱导的小胶质细胞中TLR4信号通路的激活,减少炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA与蛋白表达的水平。最后,将salvia和小胶质细胞在OGD条件下共孵育制备的条件培养基作用与神经元细胞,结果发现salvia条件培养基能够提高神经元细胞的活力,减少凋亡率,抑制神经元细胞Caspase-3信号通路的激活。3.在MCAO模型中,实验结果发现salvia（20mg/kg）能够有效的减少大鼠脑梗死面积,增加神经元细胞的有序性,血脑屏障的完整性得到部分修复。并且能够减少小胶质细胞的活化。TUNEL染色结果也发现,salvia可以减少凋亡小体的表达,Caspase-3凋亡通路相关蛋白表达显着性减少。通过Morris水迷宫和Rota-Rod转棒实验测定salvia长期作用,发现可以改善急性脑缺血再灌注损伤后大鼠的认知能力和提高大鼠运动能力。结论本课题主要从两个方面探讨salvia的药理活性:一方面是通过构建OGD诱导神经元损伤模型,发现salvia可以减少神经元细胞内ROS的表达,进而抑制Caspas-3信号通路的激活。另一方面是通过OGD诱导小胶质细胞的极化模型,发现salvia减少小胶质细胞内氧化应激反应,降低ROS的表达,进一步抑制TLR4信号通路的激活,从而减弱由小胶质细胞极化带来的神经损伤。同样在动物水平得到了进一步验证,这些结果说明salvia能够有效的减少急性脑缺血再灌注损伤,具有较好的神经保护作用。
蒋伟[6]（2020）在《ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制》文中提出脑卒中是目前致残率第一、致死率第三的神经疾病,但是脑卒中神经元死亡的分子机制并不完全清楚。本论文具体研究内容如下:（1）论文第2章提取局部脑缺血3 h的小鼠脑匀浆,与对照组小鼠脑匀浆做SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,在蛋白分子大小48 k Da左右,缺血组蛋白条带与对照组蛋白条带相比较明显减弱,结合质谱分析仪对切下来的特异条带进行质谱分析,Enolase 1（ENO1）蛋白在缺血组相比较对照组显着降低。为进一步验证ENO1在脑缺血过程中的变化,构建脑缺血1-3 h的小鼠,提取缺血区域脑匀浆用ENO1抗体进行免疫印迹杂交,在缺血早期1 h,ENO1蛋白表达水平明显上调,在脑缺血2-3 h,ENO1蛋白表达水平逐渐下调,在缺血3 h时间点,ENO1蛋白相对于对照组蛋白下降了50%左右。ENO家族有4个基因成员,提取成年C57小鼠脑、肾及肝的m RNA,反转录为CDNA,针对ENO1-4成员基因设计引物进行PCR扩增,数据显示ENO1在脑、肾及肝等组织广泛表达。为鉴定ENO1在小鼠脑不同区域及不同发育阶段的表达模式,提取成年C57小鼠的溴球、皮层、海马、脑干和小脑的m RNA和蛋白质,分别用RT-PCR和免疫印迹检测,ENO1在脑的溴球、皮层、海马、脑干和小脑都表达。提取0天、7天、14天、28天、56天小鼠的m RNA和蛋白质,用RT-PCR和免疫印迹检测,ENO1在小鼠脑发育过程中表达水平逐渐升高。小鼠脑除了神经元还有胶质细胞等其他类型细胞,为鉴定ENO1在神经元中的表达及定位,原代培养的海马神经元培养至第14天提取总蛋白质,用ENO1抗体进行免疫印迹,数据显示ENO1蛋白在神经元中表达,同时培养的海马神经元第10天,磷酸钙转染GFP质粒标记神经元,第14天用ENO1抗体免疫染色,数据表明ENO1定位神经元胞体及树突。（2）论文第3章为体外验证ENO1蛋白在脑缺血中发挥的功能,原代培养的海马神经元进行缺氧缺糖刺激（Oxgen-Glucose Deprivation,OGD）,在细胞水平模拟脑卒中。原代培养的小鼠海马神经元第14天缺氧缺糖处理1-3 h,提取蛋白质用ENO1抗体进行免疫印迹,在海马神经元缺氧缺糖刺激1 h或2 h,ENO1蛋白表达水平上调,在海马神经元缺氧缺糖刺激3 h,ENO1蛋白表达水平下调,体外数据显示ENO1呈现出动态变化,与体内数据趋势一致。为确认ENO1在缺氧缺糖刺激过程中的定位变化,海马神经元缺氧缺糖刺激2-6 h后用ENO1抗体免疫染色,数据显示ENO1在缺氧缺糖刺激过程中,胞浆中的ENO1也呈现出动态变化。在神经元中过表达PLX304-ENO1-V5质粒,缺氧缺糖刺激观察过表达ENO1蛋白的神经元与对照组神经元的损伤情况,在原代培养的海马神经元第10天用磷酸钙转染GFP质粒或GFP质粒和ENO1质粒,第14天过表达GFP或过表达ENO1组均未改变神经元的形态,缺氧缺糖刺激1 h或2 h,对照组神经元树突的长度比过表达ENO1的神经元树突长度短,对照组神经元树突棘的密度比过表达ENO1的神经元树突棘密度更低,这些数据显示,在缺氧缺糖进程中ENO1缓解神经元树突及树突棘损伤。ENO1催化产物PEP含量在小鼠脑缺血模型中呈现动态变化。培养的海马神经元添加PEP化学物质可缓解缺氧缺糖神经元损伤,立体注射PEP化学物质可降低脑缺血导致的神经元死亡。ENO1基因敲除的秀丽隐杆线虫缺氧饥饿存活率与野生型N2线虫缺氧饥饿存活率相比较没有差异。（3）论文第4章构建小鼠局部脑缺血2 h,对海马组织进行蛋白质组学和磷酸化组学分析,蛋白质组学鉴定28个蛋白发生显着性表达水平变化,磷酸化组学鉴定873个肽段磷酸化修饰显着变化,磷酸化修饰上调为135个蛋白的184个肽段,磷酸化修饰下调为420个蛋白的689个肽段。转录组学鉴定415个基因显着上调,222个基因显着下调。磷酸化组学数据进行KEGG信号通路分析,主要富集在谷氨酸突触、多巴胺突触、胞吞和突触囊泡循环。突触前囊泡调控关键蛋白synaptotagmin-1（syt1）的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。（4）论文第5章用核酸适体筛选脑缺血标记蛋白,构建脑缺血早期4h小鼠模型,以缺血同侧脑片为阳性筛选脑片,以脑缺血对侧脑片为阴性筛选脑片,经过十轮筛选富集,鉴定得到核酸适体LCW17可以稳定结合脑缺血同侧脑片。（5）论文第6章用核酸适体LCW17与脑匀浆免疫共沉淀、考马斯亮蓝染色和质谱分析,核酸适体LCW17的靶蛋白是Vigilin蛋白,核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his直接相互作用,亲和力分析实验显示核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his的结合Kd数值为25 n M左右。构建脑缺血早期梯度时间点,脑缺血时间越长,核酸适体LCW17结合脑缺血同侧脑片的数量越多,核酸适体LCW17可以用于评估脑缺血程度。原代培养的海马神经元缺氧缺糖处理,随着缺氧缺糖时间的增加,神经元分泌的Vigilin蛋白增多。立体注射核酸适体LCW17到脑缺血脑内,核酸适体LCW17在脑缺血同侧结合能力显着高于脑缺血对侧,核酸适体LCW17可以进行小鼠脑缺血体内应用。综上,本论文用小鼠构建脑缺血动物模型,蛋白质组学鉴定ENO1蛋白参与脑缺血进程,用脑卒中体外细胞模型系统,发现ENO1在缺氧缺糖的病理发生过程中,降低神经元树突及树突棘损伤,从而为理解和治疗脑卒中疾病提供了一种新的途径。磷酸化组学鉴定突触前囊泡调控关键蛋白syt1的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。基于缺血脑切片的核酸适配体筛选技术能够有效用于脑缺血疾病靶标与探针的发现,核酸适配体LCW17和Vigilin蛋白对于脑卒中疾病发生机制的研究以及疾病的诊断具有重要的意义。
张姗[7]（2020）在《纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究》文中研究说明目的:通过制备AMH靶向超声造影剂(AMH-Targeted nanobubbles,NBAMH),实现大鼠移植卵巢的靶向显影,并进一步借助NBAMH超声分子影像评价AMH分子在卵巢组织中的表达水平,实现移植卵巢存活状态的早期检测和量化评价。方法:1)第一部分:将脂质材料按一定比例混合,采用“薄膜水化法”、“机械震荡法”及“离心分离法”制备纯纳米粒径的造影剂（NBs）。通过“亲和素-生物素桥接”法将抗AMH的抗体AMH-antibody以不同的比例偶联于纳米微泡的表面制备出NBAMH。通过倒置显微镜和扫描电镜观察纳米微泡形态;马尔文粒度/电位分析仪检测微泡粒径、分散度及稳定性;荧光显微镜检测及流式细胞计数仪检测微泡携带抗体的情况及分析最佳抗体携带量及携带率;2)第二部分:体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,首先将NBAMH以不同浓度与大鼠卵巢颗粒细胞共孵育,通过CCK-8法检测纳米微泡对细胞的毒性反应。为了模拟卵巢移植后的缺氧状态,在体外建立卵巢颗粒细胞缺氧/复氧（H/R）模型,ELISA检测AMH表达水平并确定最佳的H/R时间点。将建模细胞与NBAMH共孵育,普通光镜及荧光显微镜下观察检测NBAMH对卵巢颗粒细胞的黏附性;流式细胞计数仪检测NBAMH与细胞的结合率;3)第三部分:建立大鼠卵巢移植模型,20只SD大鼠（正常大鼠10只,卵巢移植模型大鼠10只）每只大鼠经尾静脉分别随机注射NBAMH和NBs,每种造影剂注射间隔30min。超声诊断仪观察每种造影剂在大鼠卵巢组织中的增强显影效果并对造影强度进行定量分析。小动物荧光成像系统观察NBAMH在体内的分布代谢情况。病理切片激光共聚焦显微镜观察NBAMH在移植卵巢中的分布情况。在体内靶向性实验之后,再次建立大鼠卵巢皮下移植模型,移植后6h将40只大鼠随机分为4组,即移植后3天组、5天组、7天组和10天组,每组10只。通过NBAMH超声分子影像,AMH分子免疫荧光以及Western Blot进一步检测卵巢移植后不同时间点AMH分子表达水平的检测。结果:1)第一部分:通过质量控制纯纳米脂质微泡粒径为478.24±28.02nm,AMH靶向纳米微泡粒径为549.33±28.53nm,其在光学显微镜及扫描电镜下呈大小均一的纳米级空心颗粒。且在室温条件下至少60min其粒径和浓度保持稳定状态。荧光显微镜显示AMH抗体成功耦连于微泡表面;流式细胞计数仪显示AMH抗体与NBs的最佳结合率为65.3±2.7%,最佳配比为1:5;2)第二部分:不同浓度的NBs与大鼠卵巢颗粒细胞共孵育未见明显细胞毒性。细胞建模后,H/R组细胞活性明显低于对照组（常氧组）,表示体外H/R建模成功。ELISA结果显示常氧及缺氧状态下卵巢颗粒细胞均表达AMH,且其表达量至少在缺氧12h内随缺氧时间的增加而增加。最佳缺氧和复氧时间为H6/R3。体外靶向性实验显示,普通光镜及荧光显微镜下观察到NBAMH组每个颗粒细胞周边的纳米泡的数量为（35.59±2.46）明显高于NBs组和NBIg G组（P<0.001）,流式细胞计数仪显示NBAMH与细胞结合率为23.97±0.15%,明显高于NBs组和NBIg G组,差异具有统计学意义（P<0.001）;3)第三部分:体内超声造分子影像表明,在移植卵巢中NBAMH的造影强度是NBs的2.17倍（P<0.001）。小动物成像仪结果进一步证实了NBAMH在卵巢组织中的特异性分布,并在注射后30min时其荧光强度是NBs组的4.28倍。移植卵巢病理组织切片及AMH免疫荧光表明NBAMH能够进入移植卵巢组织间隙并与AMH分子特异性结合。此外,通过AMH超声分子影像监测卵巢移植后3,5,7和10天的造影信号强度。移植卵巢中的造影强度从3天到10天显着增强（P<0.001）。为验证超声检查结果,对移植卵巢组织进行组织学检查和Western Blot分析。卵泡计数以及微血管密度检测显示随着移植天数的增加卵巢组织卵泡数量以及微血管密度逐渐增加。AMH分子免疫荧光和Western Blot结果均显示相同的趋势,与超声分子成像结果相似。结论:1.本研究成功制备了AMH靶向纳米微泡并优化了其最佳配比。2.NBAMH在体外与卵巢颗粒细胞具有明显的靶向黏附作用。3.NBAMH在体内能明显增强的移植卵巢显影。4.NBAMH可用于AMH分子的在体显影和量化评价从而反映移植卵巢的存活状态。NBAMH的超声分子影像为在体、无创的动态监测移植卵巢存活状态提供了一种新的方法。
韩朝[8]（2020）在《丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究》文中研究表明背景来自实验动物疾病模型和早期临床试验的有力证据表明,神经干细胞移植是开发临床适用的外源性干细胞疗法的可行途径。基于目前在NSC生物学领域的进展和移植研究的积极成果,当代的观点是移植的NSC作为宿主本地“工厂”能够产生和分泌大量的免疫和神经营养因子,包括那些细胞外膜囊泡中包含因子,NSC移植物作为一种天然的生物制剂来源,能够调节和促进中枢神经系统（CNS）组织在急性或慢性组织损伤后的几个关键功能的恢复。但如何将NSC更为有效的定植于损伤器官组织,更加有效的让其分泌的因子作用于损伤微环境是神经组织工程亟待解决的问题。生物材料、细胞和刺激是神经组织工程的三个主要组成部分。组织工程神经材料已成为神经再生和功能恢复的一种潜在的替代自体神经移植物。各种材料的研究以改善特性和增强功能为出发点,生物可降解、生物相容、导电和免疫惰性的支架最终的目标是准确地模拟我们体内的细胞外基质,并通过各种聚合物、细胞和生长因子诱导出一种生物化学、地形学和电信号的组合,从而高效地进行神经定植及神经网络再生。选择合适的支架材料来促进神经细胞和非神经细胞的分化以及轴突的生长是神经组织工程整体设计策略的关键。在众多支架材料中,水凝胶已被证明是神经源性细胞培养和分化的良好选择。考虑到神经系统对再生的固有抗性,水凝胶已大量用于释放神经营养因子、神经生长抑制剂拮抗剂和其他神经生长促进剂。组内前期研究工作在静电力作用下获得的丝素蛋白水凝胶,电镜结果显示该凝胶具有纳米取向空隙,能够支持神经元的粘附生长。姜黄素广泛应用于各种疾病的防治。近年来,姜黄素作为神经源性和神经保护剂的应用受到越来越多的关注。姜黄素作为炎症条件因子,在神经干细胞的活力维持,神经向分化中的优势也得到了研究者的证实。目的本研究的目的分为三个方面:提取并稳定传代人胚胎来源神经干细胞,鉴定人神经干细胞的增殖能力、特异性标记物表达及分化能力,利用丝素蛋白水溶液来检验丝素蛋白是否影响神经干细胞的活力,增殖及分化能力,为后期利用丝素蛋白制备水凝胶支架结构奠定基础。通过静电场力作用丝素蛋白制备三维取向水凝胶,筛选适合的水凝胶浓度,结合NSC进行粘附培养、检测水凝胶结构对NSC的贴壁性,神经向分化能力的影响,尤其针对神经元轴突发育及伸展取向性进行研究。同步构建大鼠缺血缺氧性脑损伤模型,观察取向水凝胶及对照组无序水凝胶结合NSC移植治疗后的修复效果。探讨姜黄素作为炎症调控,多种信号激活的中药单体对NSC结合丝素水凝胶的神经组织工程组织的干预作用,为神经保护机制的研究和体外药物筛选提供新的思路。方法1.机械法消化提取人胚神经干细胞,无血清法悬浮培养法扩增神经球,CCK8检测NSC增殖能力,流式细胞仪及免疫荧光法检测神经干细胞干性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4表达。经分化培养基培养至14天,经形态学,免疫荧光检测神经元Tub3、少突胶质GFAP、小胶质细胞的特异性标记蛋白O4的表达,明确分化能力。验证提取方法获得的神经干细胞属性。利用丝素蛋白水溶液（SF）加入到神经干细胞的培养基中,观察形态学,利用CCK8及PI染色检测SF对神经干细胞增殖及死亡的影响。免疫荧光染色检测SF对NSC干性的影响。2.静电法制备0.5%、1%、2%丝素蛋白水溶液并筛选合适的水凝胶浓度,将NSC在三维取向丝素蛋白水凝胶中分化培养,并将自然形成的无序丝素蛋白水凝胶作为对照组,Calcein-AM活细胞染色观察细胞形态,检测轴突的伸展方向,分化后经Tub3及GFAP染色并量化计算NSC向神经元及神经胶质细胞的分化比例。利用Fluo-AM试剂染色经流式细胞仪检测钙离子在两种细胞中的变化,共聚焦检测轴突蛋白Bassoon在分化后神经元突触中的表达,RT-PCR检测轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp在两种细胞中的表达情况,分析有序水凝胶对轴突发育及轴突伸展的影响。3.构建大鼠缺血缺氧模型,选取三组损伤组（HI）、神经干细胞治疗组（NSC）及神经干细胞结合有序丝素蛋白水凝胶组（NSC+Silk）,每组10只。于出生后7天造模,10天治疗,28天行为学实验（圆柱筒、平衡木及水迷宫）,39天处死,固定、切片,进行GFAP免疫组化及Tub3、GFAP及Neu N的免疫荧光染色。获取海马区组织进行神经相关因子检测BDNF,NGF的ELISA检测。4.筛选1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml不同浓度的姜黄素作用于NSC,利用CCK8染色法检测NSC细胞活力。Ed U染色法检测不同浓度Cur对NSC增殖能力的影响。Annexin-V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡发生。检测不同浓度下Cur对NSC分化为神经细胞过程的影响,待分化培养12天,通过软件分析单位面积神经元数量及神经元轴突长度,收集分化培养6、12天的细胞样本检测GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达,分析姜黄素对神经向分化的作用。结果1.经机械法原代提取的神经干细胞经7-10天可以形成标准的神经球集落,海马区的NSC增殖速度快,大小均匀,形态规则,指数生长期为5-7天,P1,3,5代的NSC增殖能力一致,倍增时间无显着性差异。获取的海马区NSC表达神经干细胞特异性标记物Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2,SSEA-1,CXCR4。能够在分化培养环境下分化为具有神经元形态细胞,并部分表达Tuj1、GFAP,神经元及神经胶质细胞特异性标记蛋白。2.对照组、两种浓度0.01%及0.1%的SF作用于NSC后倍增时间分别为:65.3h、76.2h及42.2h,检测SF对NSC细胞的死亡率影响,对照组,0.01%及0.1%分别为:31.5%,38.5%,40.6%,均不具有显着性差异。0.01%浓度的SF加入至培养基经免疫荧光染色检测Nestin,Vimentin,Musashi-1,Notch,SOX1,SOX2六个神经干细胞特异性标记物表达均为阳性。3.静电场力作用获得1%浓度的取向丝素蛋白水凝胶最适合于NSC悬浮及分化培养,对比无序水凝胶材料,分化后的神经细胞在有序水凝胶表面获得的轴突伸展方向一致性提高,有序丝素蛋白水凝胶能够提升神经元的分化比例为10.7±3.1个,照比无序材料的7.3±2.5个有显着性提高,神经元轴突长度统计分析无序凝胶为105.7±10.2nm,有序凝胶为400.3±25.3nm,神经元轴突长度进行量化并统计。能够显着提高神经元的轴突长度,并增高轴突内Bassoon蛋白及的表达,GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因的表达在分化12天时发生显着升高。4.成功建立大鼠缺血缺氧模型,经NSC及NSC+Silk治疗后,脑缺损区域减小,对比损伤组GFAP表达胶质细胞在皮层区、CA1区、DG区及CA3区表达下降,但NSC组与NSC+Silk组之间没有显着性变化。治疗后神经元细胞比例增高,海马区的GFAP比例下降,海马区Neu N的表达在治疗后升高,均据有统计学差异。平衡木试验结果及圆柱桶试验均发生治疗组有明显的修复效果,水迷宫试验结果显示NSC+Silk组有更好的修复效果。在治疗后1天海马组织内的BDNF及NGF因子含量即发生显着性升高,并在后期维持高表达状态。5.1mg/ml姜黄素作用于神经干细胞,不影响NSC增殖,大于5mg/ml的Cur抑制NSC增殖。1mg/ml Cur作用后,Ed U标记率增大但无统计学差异。2.5mg/ml,5mg/ml Cur作用后阳性率降低,表明NSC的增殖率下降。1mg/ml Cur与Cont组相比较没有显着变化。表明高浓度Cur能显着诱导NSC细胞发生凋亡。0.5mg/ml,1mg/ml,2.5mg/ml浓度不影响神经干细胞的分化形态,但5mg/ml,10mg/ml浓度明显抑制神经干细胞分化后贴壁细胞的伸展。经Cur处理,单位面积的神经元数量显着高于对照组,神经元轴突的长度也在分化12天时显着高于对照组。轴突相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp的mRNA表达检测的表达在12天时照比对照组有所升高。结论1.本实验部分成功提取了人胚胎来源的海马区原代NSCs,能够稳定进行扩增培养及特异性标记物鉴定,NSC能成功分化为神经元、胶质细胞,符合NSCs的基本属性和生物学特性;2.检测了丝素蛋白水溶液作为支架材料的生物安全性,评价了其对NSCs形态学、增殖能力及干性能力均无影响,体现了其良好的生物相容性。可作为后续的神经组织工程材料进行深入研究。1%浓度的丝素蛋白水凝胶能够支持神经干细胞增殖。静电作用获得的有序丝素蛋白水凝胶能够提高神经干细胞向神经元分化比例。有序丝素蛋白水凝胶在向神经细胞分化中能够增强神经元轴突GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp基因表达,促进神经突触的发育及迁移。有序丝素蛋白水凝胶结合NSC治疗大鼠脑缺血缺氧模型,对运动行为及学习记忆有修复功效。3.高浓度（>2.5mg/ml）姜黄素导致NSC细胞死亡,低浓度（<1mg/ml）促进NSC细胞增殖。1mg/ml姜黄素能够促进人神经干细胞向神经元分化,提高分化效率,提高分化后神经元突触长度及突触相关基因GAP-43、NCAM1、PSD-95和Syp表达。
刘娜[9]（2020）在《咖啡因促进少突胶质细胞组蛋白乙酰化对缺血缺氧新生大鼠脑白质损伤的保护作用研究》文中研究表明目的:早产儿脑白质损伤（WMI）是早产儿脑损伤最常见的表现形式,严重者可发生脑室周围白质软化（PVL）。目前认为,WMI是导致早产儿远期不良神经预后的主要因素,其神经系统后遗症呈现多样性,涉及到肢体运动障碍、认知行为功能障碍、智力障碍及视觉、听觉障碍等。传统观点认为WMI病理改变主要涉及早期的少突胶质细胞损伤及后续的髓鞘化障碍。然而单纯的髓鞘化障碍无法充分解释WMI早产儿神经系统后遗症的多样性,突触损伤可能与后遗症多样性相关。研究者在尸检中发现,某些WMI患儿脑组织中存在神经元损伤,提示可能存在突触损伤,以丘脑区域最为明显。但目前该方面的研究不多,基于此病理改变的WMI治疗探索更加少见。早产儿WMI临床表现不典型,诊断滞后,且确诊后缺乏安全有效的治疗措施,一直是困扰新生儿医师的难点。多中心的临床随机对照研究发现,早产儿生后早期应用咖啡因防治呼吸暂停,可以有效降低支气管肺发育不良（BPD）发生率,改善神经系统远期预后。然而咖啡因改善早产儿神经预后是否通过改善早产儿WMI实现,目前尚不清楚。咖啡因是一种非特异性的腺苷受体阻断剂,能够有效的阻断腺苷受体的功能,尤其是A1及A2A受体,进一步影响呼吸中枢功能,改变呼吸节律,从而治疗早产儿呼吸暂停。但咖啡因改善早产儿神经预后的具体机制目前尚不明确。因此,本研究利用缺血缺氧诱导的新生大鼠脑白质损伤模型,研究缺血缺氧新生大鼠发生髓鞘化障碍的同时是否发生突触损伤,验证咖啡因是否对新生大鼠脑白质损伤具有神经保护作用,是否能改善髓鞘化障碍及突触损伤,并筛选咖啡因最佳用药剂量,探究咖啡因通过影响少突胶质细胞组蛋白乙酰化水平及BDNF/p-TrkB表达改善新生大鼠脑白质损伤的机制。研究方法:1.选取3日龄Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为对照组和缺血缺氧（HI）组（每组均为82只）。缺血缺氧组于3日龄行右颈总动脉结扎后低氧暴露（8%氧气2.5h）制备脑白质损伤模型。分别于模型制备后3天,7天,14天,21天采集标本。采用HE染色观察脑组织病理改变;采用Western blotting检测突触前蛋白synaptophysin、突触后蛋白PSD-95、髓鞘蛋白MBP的表达;采用免疫荧光检测synaptophysin及MBP表达;采用免疫组化检测PSD-95表达;采用免疫荧光对少突胶质细胞总标志物Olig2染色,检测细胞数目;采用透射电镜检测突触数目及超微结构改变;采用水迷宫实验检测缺血缺氧新生大鼠的学习认知行为变化。2.选取2日龄大鼠80只随机分为5组（每组均为16只）:对照组、缺血缺氧（HI）组、HI+咖啡因（10mg/kg）组、HI+咖啡因（20mg/kg）组、HI+咖啡因（50mg/kg）组。咖啡因于大鼠2日龄至6日龄连续腹腔内注射,共5天（每天一次）,缺血缺氧处理依旧在3日龄进行。记录各组大鼠体重及脑重改变;采用Western blotting检测缺血缺氧后14天各组MBP表达,筛选最佳咖啡因剂量,以此剂量进行后续实验。3.选取2日龄大鼠54只随机分为3组（每组均为18只）:对照组、HI组、HI+咖啡因（最佳剂量）组。咖啡因给药时间及方式同前,缺血缺氧处理依旧在3日龄进行。采用Western blotting检测各组缺血缺氧后14天synaptophysin及PSD-95表达,采用免疫荧光检测各组synaptophysin表达,采用透射电镜检测各组突触数目及超微结构改变;采用水迷宫实验检测各组大鼠的学习认知行为;水迷宫实验结束后大鼠进行MBP免疫组化检测和透射电镜髓鞘超微结构检测。4.选取2日龄大鼠64只随机分为4组（每组均为16只）:对照组、HI组、HI+咖啡因组、HI+咖啡因+ANA-12组（TrkB抑制剂）。咖啡因给药时间及方式同前,缺血缺氧处理依旧在3日龄进行,ANA-12用药时间与咖啡因一致（2日龄至6日龄,腹腔内注射,每日一次,0.5mg/kg）。缺血缺氧后7天,乙酰化组蛋白AH3与Olig2免疫荧光双染检测蛋白表达,对BDNF、p-TrkB以及原始少突胶质细胞标志物PDGFR-α免疫荧光染色检测蛋白表达;缺血缺氧后14天,对成熟少突胶质细胞标志物PLP及MBP免疫荧光染色检测蛋白表达。结果:1.（1）缺血缺氧后大鼠少突胶质细胞减少,MBP表达下降:免疫荧光显示,缺血缺氧后7天,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧胼胝体（CC）区少突胶质细胞数目减少（P<0.001）,缺血缺氧后14天,髓鞘化的神经纤维长度缩短、密度下降。Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI组大鼠结扎侧CC区MBP表达低于对照组（P<0.01）;（2）缺血缺氧后大鼠丘脑区突触超微结构及突触前后蛋白表达改变:透射电镜显示,缺血缺氧后14天,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧丘脑区突触数目减少（P<0.01）,突触AZ长度及PSD厚度均下降（P均<0.05）。Western blotting显示,HI组大鼠结扎侧丘脑区突触前蛋白synaptophysin在缺血缺氧后7天（P<0.05）、14天（P<0.01）均低于对照组,而突触后蛋白PSD-95在缺血缺氧后14天（P<0.01）、21天（P<0.05）低于对照组;（3）缺血缺氧后大鼠的学习认知能力下降:水迷宫测试显示,与对照组相比,HI组大鼠在定位航行测试中逃避潜伏期延长（P均<0.05）,在空间探索测试中,HI组大鼠穿越平台次数显着减少（P<0.01）,目标象限运动时间缩短（P<0.05）。2.（1）不同剂量咖啡因干预后大鼠的体重、脑重改变:缺血缺氧后14天,与对照组相比,HI+咖啡因（50mg/kg）组大鼠出现体重及脑重下降（P均<0.05）,而HI+咖啡因（20mg/kg）组体重及脑重均与对照组无差异;（2）不同剂量咖啡因干预后大鼠MBP表达改变:Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI+咖啡因（20mg/kg）组大鼠结扎侧CC区MBP表达高于HI组（P<0.05）,而HI+咖啡因（50mg/kg）组及HI+咖啡因（10mg/kg）组MBP表达与HI组无统计学差异。结果表明,咖啡因干预剂量20mg/kg对缺血缺氧新生大鼠MBP下降改善效果最佳,选此剂量进行后续实验。3.（1）咖啡因改善缺血缺氧大鼠的学习认知能力:水迷宫测试显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠在定位航行测试中逃避潜伏期缩短（P均<0.05）,在空间探索测试中,HI+咖啡因组大鼠穿越平台次数增加（P<0.05）,目标象限运动时间延长（P<0.05）;（2）咖啡因对缺血缺氧大鼠MBP表达以及髓鞘超微结构的影响:MBP免疫组化显示缺血缺氧后30天,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠结扎侧CC区向皮层投射的髓鞘化神经纤维长度延长、密度增加;透射电镜显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠髓鞘结构更加规则,髓鞘化轴突数目增多;（3）咖啡因对缺血缺氧大鼠突触超微结构及突触前后蛋白表达的影响:透射电镜显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠结扎侧丘脑区突触数目增加（P<0.05）,但突触AZ长度及PSD厚度与HI组无显着差异;Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI组结扎侧丘脑区synaptophysin（P<0.01）及PSD-95（P<0.05）表达均低于对照组,而HI+咖啡因组synaptophysin及PSD-95的表达与HI组无显着差异。4.（1）咖啡因增加缺血缺氧新生大鼠乙酰化组蛋白AH3及下游BDNF/p-TrkB表达:免疫荧光定量分析显示,与对照组相比,缺血缺氧后7天,HI组大鼠结扎侧CC区少突胶质细胞AH3表达下降（P<0.01）,其下游的BDNF及p-TrkB表达减少（P均<0.01）,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠少突胶质细胞AH3表达增加（P<0.05）,其下游BDNF（P<0.01）及p-TrkB（P<0.001）表达水平也升高;（2）咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化:免疫荧光定量分析显示,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧CC区成熟少突胶质细胞标记物PLP（P<0.01）及MBP（P<0.001）表达下降,而原始少突胶质细胞标记物PDGFR-α表达无显着改变;与HI组相比,HI+咖啡因组PDGFR-α（P<0.01）、PLP（P<0.05）表达均增多,MBP表达升高（P<0.01）;（3）TrkB抑制剂ANA-12减弱咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化的效用:免疫荧光定量分析显示,与HI+咖啡因组相比,HI+咖啡因+ANA-12组p-TrkB表达下降（P<0.01）,PDGFR-α、PLP及MBP表达均减少（P均<0.05）。结论:1.缺血缺氧诱导的新生大鼠WMI不仅局限于脑室旁白质髓鞘化障碍,同时伴随丘脑区突触超微结构异常,为早产儿WMI提供了更加全面的病理诠释。2.咖啡因通过改善脑室旁白质髓鞘化障碍对缺血缺氧新生大鼠WMI发挥神经保护作用,提高其认知及学习能力,但对异常的突触超微结构无显着改善,为早产儿WMI的临床治疗提供了新的方向。3.咖啡因能够提高缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞中乙酰化组蛋白AH3水平,上调BDNF及p-TrkB表达,促进少突胶质细胞分化,最终改善髓鞘化障碍,可能是咖啡因对缺血缺氧诱导的新生大鼠WMI发挥神经保护作用的机制。
金娟[10]（2020）在《微纳气泡界面脂质分子自组装及应用研究》文中进行了进一步梳理超声医学技术具有安全、快捷和低成本的优势而被广泛应用。近年来,微纳气泡作为超声造影剂与药物载体系统,在分子成像、药物递送、介导基因治疗和血栓溶栓等方面表现出广阔的应用前景。脂质包覆的气泡具有良好的生物相容性,目前批准上市的超声造影剂,如Definity,Imagent和Sono Vue均属于脂质类造影剂。现有文献中报道的脂质气泡的粒径为微米尺度,局限于血管中,且相对复杂的制备方法限制了其临床应用。医学与健康技术的快速发展,对兼具简单高效制备和优异造影效果的微纳气泡不断提出新的需求。本论文以制备自由微纳气泡为基础,利用磷脂分子可在气泡界面进行自组装,提出并形成了一种简单高效的脂质超声造影剂的新型制备方法;利用该方法制备出包覆氙气的纳米气泡,尝试用于缺血性脑卒中的治疗。研究工作主要分为以下几个部分:首先,提出一种往复压差法制备自由微纳气泡的方法。对所制备的自由纳米气泡（NBs）的形成、破裂和稳定性机理进行探究。其次,研究通过磷脂分子在气泡界面的自组装构建微米和纳米级脂质包膜气泡。其三,将氙气包覆于磷脂包膜的纳米气泡中,并研究其体内外的神经保护作用,探究了其在缺血性脑卒中治疗中的潜在应用。具体内容包括以下几个部分:（1）通过往复压差法制备自由微纳气泡,系统研究了纳米气泡制备参数的影响及其稳定性。结果表明,通过该方法首先形成约1050μm的微气泡,然后微气泡缩小并在体相中检测到纳米气泡的存在。气泡平均粒径为240±9 nm,PDI为0.25,且具有高的负zeta电位（-40±2 m V）。NBs的浓度与压缩次数呈正相关关系,反复压缩600次,NBs浓度可达到约1.92×1010/m L。动态光散射（DLS）和zeta电位表明,NBs能稳定存在超过48小时。全反射红外光谱（ATR-FTIR）测定表明,微气泡在缩小过程中,水分子中的O-H伸缩振动峰向低波数方向移动,形成了更强的氢键,推测NBs的稳定性与气泡界面强氢键有关。（2）制备出三种不同气体（氙气,空气和六氟化硫）的自由微纳气泡,利用暗场显微镜（DFM）的原位实时观察、体外超声显影评价、自由基检测等方法研究了NBs的动态演变过程。DFM结果表明,NBs在微气泡收缩后形成,且含不同气体的微气泡具有不同的收缩速率,与气体在水中的渗透阻力系数有关。但是当微气泡缩小形成NBs后,含不同气体的NBs的粒径、表面电位没有显着性差异。对体相中NBs的运动分析表明,NBs在液相溶液中做被动布朗运动。当样品位于固/液/气接触线时,NBs、固体颗粒和液滴具有不同的动力学过程,NBs易于在接触线处爆破并产生辐射力影响周围气泡运动,且荧光探针检测到羟基自由基的产生。由于内核气体对NBs的影响很小,推测NBs界面溶剂水分子的氢键网络是NBs稳定性的关键因素。（3）基于自由气泡的气液界面,提出利用温度调控进行磷脂分子自组装制备包膜气泡的新方法,研究磷脂分子组装机理,并对制备的气泡的体内外超声造影增强效果进行考察。结果表明,将二硬脂磷酯酰胆碱（DSPC）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPEPEG2K）直接分散在缓冲液中,加热至60℃与自由气泡混合,降至室温即可获得磷脂包膜气泡。气泡浓度为（2.06±0.9）×109/m L,5小时内保持稳定。进一步地,可通过改变磷脂成分中DSPE-PEG2K的含量,来调节膜壳的曲率,进而调节气泡的尺寸,并制备了直径约为1.68±0.11μm,704±7 nm和208±6 nm的气泡。体外超声成像显示,不同尺寸的气泡均具有良好的超声显影能力,随着气泡尺寸的减小,超声成像时间延长。小鼠肝脏的超声成像表明,与微气泡相比,纳米尺寸的气泡具有更长的成像持续时间（可达8 min）,且在肝脏中的显影区域扩大,可获得更详细的血管信息。（4）最后,基于磷脂自组装的方法制备了包覆氙气的纳米气泡,在细胞和动物水平探究其对缺糖缺氧损伤下的神经保护作用。氙气纳米气泡平均尺寸为205±10 nm,Xe的含量为73±2μL/m L。体外实验表明,氙气纳米气泡能使缺糖缺氧处理后的PC12细胞存活率恢复至与正常对照组无明显差异。体内实验表明,氙气纳米气泡可有效治疗小鼠缺血性脑卒中,减少脑梗死面积、促进神经功能恢复、持续改善缺血侧血流再通。免疫荧光分析表明,纳米气泡能够穿过血管进入神经细胞。
二、Using laser confocal scanning microscope to study ischemia-hypoxia injury in rat brain slice（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Using laser confocal scanning microscope to study ischemia-hypoxia injury in rat brain slice（论文提纲范文）
（1）多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒靶向治疗心脏病的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒构建及其性能表征 |
| 2.1 基于β-CD材料的合成和表征 |
| 2.2 材料体外清除ROS能力评价 |
| 2.3 基于多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒的构建 |
| 2.4 生物活性纳米粒表征及稳定性评价 |
| 2.5 生物活性纳米粒形成机制初步探究 |
| 2.6 生物活性纳米粒体外ROS清除及响应性水解能力评价 |
| 2.7 全章小结 |
| 第三章 多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒体外生物活性评价 |
| 3.1 生物活性纳米粒的心肌细胞摄取研究 |
| 3.2 生物活性纳米粒在氯化钴诱导的心肌细胞缺血缺氧模型中应用 |
| 3.3 生物活性纳米粒在异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大模型中应用 |
| 3.4 全章小结 |
| 第四章 多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒在大鼠心脏骤停复苏后心肌损伤模型中的疗效评价 |
| 4.1 室颤法致大鼠心脏骤停复苏后心肌损伤模型建立 |
| 4.2 生物活性纳米粒在模型鼠体内血液循环特性及心脏靶向性研究 |
| 4.3 生物活性纳米粒对心脏骤停后复苏大鼠的治疗作用评价 |
| 4.4 全章小结 |
| 第五章 多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒在小鼠心肌肥大模型中的疗效评价 |
| 5.1 小鼠心肌肥大模型建立 |
| 5.2 生物活性纳米粒在小鼠中血液循环特性及心脏靶向性研究 |
| 5.3 生物活性纳米粒对心肌肥大小鼠的治疗作用评价 |
| 5.4 全章小结 |
| 第六章 多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒初步安全性评价 |
| 6.1 生物活性纳米粒的细胞毒性评价 |
| 6.2 生物活性纳米粒的溶血性评价 |
| 6.3 生物活性纳米粒治疗心肌肥大的安全性评价 |
| 6.4 全章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 靶向缺血心肌的功能化纳米药物治疗策略及其应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 AMPARs转运调节与突触可塑性之间的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（3）δ-catenin相关的GluR2内化在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 δ-catenin在新生小鼠HIBD中的作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 δ-catenin对缺氧缺血后神经元GluR2 内化的作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 AMPA受体的转运及其功能调控 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）3巯基丙酮酸硫转移酶产生的硫化氢对缺血缺氧性损伤的脑血管内皮细胞保护作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 实验动物 |
| 2.2. 人体血管标本 |
| 2.2.1. 研究对象 |
| 2.2.2. 入选标准 |
| 2.2.3. 排除标准 |
| 2.2.4. 血管标本采集 |
| 2.3. 主要试剂和来源 |
| 2.4. 实验仪器 |
| 2.5. 实验方法和研究内容 |
| 2.5.1. 细胞实验 |
| 2.5.1.1. 大鼠脑血管内皮细胞原代培养 |
| 2.5.1.2. 细胞免疫荧光 |
| 2.5.1.3. OGD/R模型和药物处理 |
| 2.5.1.4. 细胞线粒体琥珀酸脱氢酶实验和实验分组 |
| 2.5.1.5. 细胞H2S含量检测 |
| 2.5.1.6. 细胞ROS检测 |
| 2.5.1.7. 细胞总抗氧化能力 ( total antioxidativecapacity,T-AOC)和ATP检测 |
| 2.5.1.8. 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.5.2. 线粒体实验 |
| 2.5.2.1. 线粒体分离及纯化 |
| 2.5.2.2. 线粒体H2S含量检测 |
| 2.5.2.3. 线粒体超微结构检测 |
| 2.5.2.4. 线粒体ROS检测 |
| 2.5.2.5. 线粒体ATP合酶和ATP水平检测 |
| 2.5.2.6. 线粒体膜电位(ΔΨm)检测 |
| 2.5.2.7. Rho A活性检测 |
| 2.5.2.8. Western blotting |
| 2.5.3. 小鼠在体实验 |
| 2.5.3.1. 小鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型制备 |
| 2.5.3.2. 实验分组及给药 |
| 2.5.3.3. 脑血流量监测 |
| 2.5.3.4. 神经功能评分和脑梗死体积检测 |
| 2.5.3.5. 血管HE染色 |
| 2.5.3.6. 血管H2S含量检测 |
| 2.5.3.7. 免疫组织化学 |
| 2.5.4. 人体血管实验 |
| 2.5.4.1. HE染色、TEM观察、H2S和免疫印迹检测 |
| 2.5.4.2. 血管组织免疫荧光 |
| 2.6. 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1.3-MP和L-Asp对大鼠原代脑血管内皮细胞OGD/R的影响 |
| 3.1.1. 原代脑血管内皮细胞的培养与鉴定 |
| 3.1.2.3-MP和L-Asp对正常培养原代内皮细胞活力的影响 |
| 3.1.3.3-MP和L-Asp对OGD/R条件下原代内皮细胞琥珀酸脱氢酶活性的影响 |
| 3.1.4.3-MP和L-Asp对OGD/R损伤后ECs的H2S含量和 3-MST表达变化的影响 |
| 3.1.5.3-MP和L-Asp对内皮细胞OGD/R损伤氧化应激和能量产生的影响 |
| 3.2.3-MP和L-Asp对大鼠原代脑血管内皮细胞线粒体OGD/R损伤的影响 |
| 3.2.1. 内皮细胞线粒体存在 3-MST |
| 3.2.2.3-MP和L-Asp对内皮细胞线粒体OGD/R损伤后H2S含量和 3-MST表达变化的影响 |
| 3.2.3.3-MP和L-Asp对内皮细胞线粒体OGD/R损伤线粒体超微结构变化的影响 |
| 3.2.4.3-MP和L-Asp对内皮细胞线粒体OGD/R损伤氧化应激变化的影响 |
| 3.2.5.3-MP和L-Asp对内皮细胞线粒体OGD/R损伤能量产生变化的影响 |
| 3.2.6.3-MP和L-Asp对内皮细胞线粒体OGD/R损伤膜电位变化的影响 |
| 3.3.3-MP和L-Asp对内皮细胞及线粒体Rho A/ROCK信号通路变化的影响 |
| 3.3.1. Rho A,ROCK1以及ROCK2部分定位于内皮细胞线粒体 |
| 3.3.2.3-MP和L-Asp对内皮细胞OGD/R损伤线粒体除外细胞裂解液和线粒体Rho A活性变化的影响 |
| 3.3.3.3-MP和L-Asp对内皮细胞OGD/R损伤线粒体除外细胞裂解液和线粒体ROCK蛋白表达变化的影响 |
| 3.4.3-MP和L-Asp对CSE-/-小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤的影响 |
| 3.4.1. MCAO/R模型的验证 |
| 3.4.2.3-MP和L-Asp对CSE-/-小鼠MCAO/R脑血流量的影响 |
| 3.4.3.3-MP和L-Asp对CSE-/-小鼠MCAO/R脑中动脉H2S含量的影响 |
| 3.4.4.3-MP和L-Asp对CSE-/-小鼠MCAO/R后脑血管内皮形态的影响 |
| 3.4.5.3-MP和L-Asp对CSE-/-小鼠MCAO/R后脑血管内皮Rho A,ROCK1和ROCK2表达的影响 |
| 3.5. MCI对患者脑血管内皮的影响 |
| 3.6. MCI对患者脑血管H_2S含量及 3-MST表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1.3-MST产生的H_2S对ECs的缺氧复氧性损伤具有保护作用 |
| 4.2.3-MST产生的H_2S对缺氧复氧性损伤的ECs的线粒体具有保护作用 |
| 4.3.3-MST产生的H_2S对ECs的缺氧复氧性损伤保护作用的机制 |
| 4.4.3-MST产生的H_2S对小鼠缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的机制 |
| 4.5. 人缺血性脑损伤脑血管中 3-MST和H_2S的变化 |
| 4.6. 研究局限性 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 内源性 H_2S 与线粒体生物能量学 |
| 参考文献 |
（5）丹参多酚酸盐通过调控小胶质细胞对神经元损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 参考文献 |
| 第二章 丹参多酚酸盐对体外神经元细胞损伤的保护及机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 缺氧缺糖模型建立 |
| 2.2.3 药物细胞毒测定实验 |
| 2.2.4 药物活力测定实验 |
| 2.2.5 细胞膜染色实验 |
| 2.2.6 NO,MDA,LDH测定实验 |
| 2.2.7 活性氧(ROS)测定实验 |
| 2.2.8 Hoechst 33342染色实验 |
| 2.2.9 细胞凋亡测定实验 |
| 2.2.10 mRNA提取实验 |
| 2.2.11 RT-qPCR实验 |
| 2.2.12 细胞蛋白提取实验 |
| 2.2.13 Western blotting实验 |
| 2.2.14 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 细胞缺氧缺糖模型的条件筛选 |
| 2.3.2 丹参多酚酸盐对PC12细胞毒测定 |
| 2.3.3 丹参多酚酸盐对OGD-PC12细胞的保护作用 |
| 2.3.4 丹参多酚酸盐抑制OGD-PC12细胞ROS的表达 |
| 2.3.5 丹参多酚酸盐影响OGD-PC12细胞的LDH,NO,MDA表达 |
| 2.3.6 丹参多份酸盐对OGD-PC12细胞的抗凋亡作用 |
| 2.3.7 丹参多酚酸盐影响OGD-PC12细胞Caspase-3凋亡通路蛋白表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 丹参多酚酸盐对体外小胶质细胞极化的作用及机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 常用溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 缺氧缺糖模型建立 |
| 3.2.3 药物细胞毒测定实验 |
| 3.2.4 细胞膜染色实验 |
| 3.2.5 LDH及NO测定实验 |
| 3.2.6 细胞表型荧光染色实验 |
| 3.2.7 ROS免疫荧光染色实验 |
| 3.2.8 Hoechst 33342染色实验 |
| 3.2.9 条件培养基制备实验 |
| 3.2.10 细胞凋亡测定实验 |
| 3.2.11 ROS流式测定实验 |
| 3.2.12 mRNA提取实验 |
| 3.2.13 RT-qPCR实验 |
| 3.2.14 ELISA测定实验 |
| 3.2.15 SOD,GSH,CAT酶活力测定实验 |
| 3.2.16 细胞蛋白提取实验 |
| 3.2.17 Western Blotting实验 |
| 3.2.18 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小胶质细胞株免疫荧光鉴定结果 |
| 3.3.2 小胶质细胞缺氧缺糖模型的条件筛选 |
| 3.3.3 丹参多酚酸盐对小胶质细胞活力测定 |
| 3.3.4 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞内ROS表达 |
| 3.3.5 丹参多酚酸盐影响小胶质细胞内抗氧化酶表达 |
| 3.3.6 丹参多酚酸盐影响小胶质细胞的炎症表型变化 |
| 3.3.7 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞TLR4信号通路蛋白表达 |
| 3.3.8 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞炎症因子的表达 |
| 3.3.9 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞极化提高神经元细胞活力 |
| 3.3.10 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞极化减少神经元细胞的凋亡 |
| 3.3.11 丹参多酚酸盐抑制小胶质细胞极化减少神经元细胞Caspase-3通路激活 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 常用溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MCAO模型构建 |
| 4.2.2 药物浓度筛选实验 |
| 4.2.3 Longa神经功能评价 |
| 4.2.4 TTC染色实验 |
| 4.2.5 激光散斑血流成像实验 |
| 4.2.6 血脑屏障完整性实验 |
| 4.2.7 脑水肿测定实验 |
| 4.2.8 HE染色实验 |
| 4.2.9 Nissl染色实验 |
| 4.2.10 免疫荧光染色实验 |
| 4.2.11 TUNEL荧光染色实验 |
| 4.2.12 组织蛋白提取实验 |
| 4.2.13 Western Blotting实验 |
| 4.2.14 水迷宫实验 |
| 4.2.15 转棒仪实验 |
| 4.2.16 数据统计 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的药物浓度结果 |
| 4.3.2 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的血流成像结果 |
| 4.3.3 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的HE染色结果 |
| 4.3.4 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的Nissl染色结果 |
| 4.3.5 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的NeuN染色结果 |
| 4.3.6 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤的血脑屏障的影响 |
| 4.3.7 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注的组织TUNEL染色实验 |
| 4.3.8 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤神经元凋亡蛋白表达影响 |
| 4.3.9 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞染色结果 |
| 4.3.10 丹参多酚酸盐对急性脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞表型转化结果 |
| 4.3.11 丹参多酚酸盐对脑缺血再灌注损伤的长期给药实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脑卒中概况 |
| 1.2 影响脑卒中疾病的主要因素 |
| 1.3 脑卒中疾病治疗 |
| 1.4 脑卒中机制研究 |
| 1.5 脑卒中模型 |
| 1.6 脑卒中研究方法 |
| 1.7 脑卒中相关蛋白 |
| 1.8 本研究论文的构思 |
| 第2章 蛋白质组学鉴定ENO1调控脑缺血神经损伤 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠局部脑缺血模型构建 |
| 2.3.2 脑缺血早期海马CA1区神经元死亡程度研究 |
| 2.3.3 缺血3 h小鼠脑匀浆考染检测 |
| 2.3.4 小鼠ENO1参与脑缺血鉴定 |
| 2.3.5 小鼠ENO1在脑缺血早期表达水平研究 |
| 2.3.6 小鼠ENO1基因在不同器官组织的表达谱 |
| 2.3.7 小鼠ENO1在脑不同区域及时间的表达谱 |
| 2.3.8 海马神经元ENO1表达及定位研究 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 ENO1在脑缺血早期神经损伤功能及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器与材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 海马神经元缺氧缺糖模型构建 |
| 3.3.2 ENO1蛋白表达水平在脑缺血体外模型中动态变化 |
| 3.3.3 神经元过表达ENO1在缺氧缺糖的功能研究 |
| 3.3.4 海马神经元干扰ENO1-2表达增加缺氧缺糖神经损伤 |
| 3.3.5 小鼠局部脑缺血后ENO1产物PEP检测 |
| 3.3.6 烯醇式丙酮酸对神经元缺氧缺糖的影响 |
| 3.3.7 体内注射PEP降低脑缺血神经元死亡率及梗死体积 |
| 3.3.8 线虫缺氧饥饿模型构建 |
| 3.3.9 ENO1 敲除线虫缺氧饥饿研究 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 磷酸化组学鉴定syt1调控脑缺血神经损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器与材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠局部脑缺血早期海马蛋白磷酸化修饰鉴定 |
| 4.3.2 小鼠局部脑缺血2h海马蛋白磷酸化组学 |
| 4.3.3 神经元syt1磷酸化在缺氧缺糖的功能研究 |
| 4.3.4 神经元syt1磷酸化在缺氧缺糖的机制研究 |
| 4.3.5 秀丽隐杆线虫SNT-1敲除突变体抵抗缺氧饥饿损伤 |
| 4.3.6 秀丽隐杆线虫SNT-1敲除外源拯救缺氧饥饿 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 核酸适体筛选脑缺血标记蛋白 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验仪器和材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 脑缺血早期组织切片进行核酸适体筛选 |
| 5.3.2 核酸适体筛选监控 |
| 5.3.3 核酸适体LCW17研究 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 核酸适体LCW17及其靶蛋白研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验仪器和材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 核酸适体LCW17靶蛋白鉴定 |
| 6.3.2 核酸适体LCW17亲和力分析 |
| 6.3.3 核酸适体LCW17脑缺血程度诊断 |
| 6.3.4 核酸适体LCW17体内研究 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 附录 B 攻读学位期间所发明的专利 |
（7）纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及特性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 AMH靶向纳米泡对大鼠卵巢颗粒细胞的体外靶向性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 AMH靶向纳米微泡对大鼠移植卵巢的体内超声分子影像研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 超声分子影像学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人神经干细胞原代提取及丝素蛋白作为神经组织工程材料安全性分析 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基配置 |
| 2.方法 |
| 2.1 人神经干细胞(hNSC)的原代培养、传代、冷冻、复苏 |
| 2.2 NSC分化实验 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 神经干细胞免疫荧光鉴定 |
| 2.5 流式细胞仪检测NSC死亡率 |
| 2.6 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同脑区神经干细胞原代提取形态学 |
| 2.海马区神经干细胞形态学 |
| 3.神经干细胞增殖能力 |
| 4.神经干细胞特异性标记物表达 |
| 5.分化后神经细胞形态及标记物表达 |
| 6.丝素蛋白水溶液对神经干细胞形态及生长活力的影响 |
| 7.丝素蛋白水溶液对NSC死亡率的影响 |
| 8.丝素蛋白水溶液对NSC干性的影响 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第二部分 丝素蛋白水凝胶通过影响NSC的轴突发育治疗大鼠缺血缺氧性脑损伤 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 丝素蛋白水凝胶制备及细胞结合培养 |
| 2.2 分化后神经细胞轴突长度及相关基因检测 |
| 2.3 NSC结合水凝胶对缺血缺氧模型的治疗 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度丝蛋白凝胶材料对神经干细胞悬浮生长状态的影响 |
| 2.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的形态学 |
| 3.分化NSC在丝素蛋白水凝胶上的神经元与神经胶质比例 |
| 4.丝素蛋白水凝胶培养后神经元轴突长度 |
| 5.丝素蛋白水凝胶培养后Bassoon蛋白表达 |
| 6.有序丝素蛋白水凝胶对NSC突触可塑性的影响 |
| 7.SD大鼠缺血缺氧模型构建及NSC治疗 |
| 8.NSC+Silk治疗对Tub-3及GFAP表达的影响 |
| 9.NSC+Silk治疗对Neu N蛋白表达的影响 |
| 10.鼠缺血缺氧模型经治疗后运动受损情况 |
| 11.鼠缺血缺氧模型治疗后学习记忆功能改善 |
| 12.海马组织内神经相关因子表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第三部分 姜黄素对神经组织工程组织的作用及机制研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 姜黄素的配制 |
| 2.2 EdU标记率测定 |
| 2.3 细胞凋亡实验 |
| 2.4 轴突数据处理 |
| 2.5 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.不同浓度Cur对 NSC细胞毒性检测 |
| 2.不同浓度Cur对 NSC增殖能力的影响 |
| 3.不同浓度Cur对 NSC凋亡的影响 |
| 4.不同浓度Cur对 NSC分化形态的影响 |
| 5.姜黄素影响分化神经元轴突长度 |
| 6.姜黄素对分化后神经元轴突相关基因表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 综述 神经组织工程(NTE)研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）咖啡因促进少突胶质细胞组蛋白乙酰化对缺血缺氧新生大鼠脑白质损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :缺血缺氧致新生大鼠脑白质损伤及行为学改变的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料试剂和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 研究对象分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 模型制备 |
| 2.3.2 标本采集 |
| 2.3.3 组织固定、石蜡包埋及切片 |
| 2.3.4 HE染色 |
| 2.3.5 免疫组化染色 |
| 2.3.6 免疫荧光染色 |
| 2.3.7 Western blotting检测 |
| 2.3.8 透射电镜 |
| 2.3.9 水迷宫实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 缺血缺氧损伤后大鼠脑室旁白质区的病理学改变 |
| 3.2 缺血缺氧损伤后大鼠脑室旁白质区MBP表达下降 |
| 3.3 缺血缺氧损伤后大鼠脑室旁白质区少突胶质细胞数目减少 |
| 3.4 缺血缺氧损伤后大鼠丘脑区突触数目及超微结构改变 |
| 3.5 缺血缺氧损伤后大鼠丘脑区synaptophysin及 PSD-95 表达变化 |
| 3.6 缺血缺氧损伤后大鼠的学习及认知能力下降 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :咖啡因对缺血缺氧新生大鼠脑白质损伤保护作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料试剂和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 研究对象分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 模型制备 |
| 2.3.2 标本采集 |
| 2.3.3 组织固定、石蜡包埋及切片 |
| 2.3.4 大鼠体重及脑组织重量测定 |
| 2.3.5 免疫组化染色 |
| 2.3.6 免疫荧光染色 |
| 2.3.7 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.3.8 透射电镜 |
| 2.3.9 水迷宫实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同剂量咖啡因干预后大鼠的体重、脑重改变 |
| 3.2 不同剂量咖啡因干预后大鼠脑室旁白质区MBP表达 |
| 3.3 咖啡因改善缺血缺氧大鼠的学习及认知能力 |
| 3.4 咖啡因改善缺血缺氧后大鼠髓鞘超微结构,提高MBP表达 |
| 3.5 咖啡因干预后大鼠丘脑区突触数目及超微结构改变 |
| 3.6 咖啡因不能增加缺血缺氧后大鼠丘脑区synaptophysin及 PSD-95 表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :咖啡因促进少突胶质细胞组蛋白乙酰化改善缺血缺氧新生大鼠髓鞘化障碍的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料试剂和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 研究对象分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 模型制备 |
| 2.3.2 标本采集 |
| 2.3.3 组织固定、石蜡包埋及切片 |
| 2.3.4 免疫荧光染色 |
| 2.3.5 免疫组化染色 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 咖啡因增加缺血缺氧新生大鼠乙酰化组蛋白及下游BDNF/p-Trk B表达 |
| 3.2 咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化 |
| 3.3 Trk B抑制剂ANA-12 减弱咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化成熟的效用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）微纳气泡界面脂质分子自组装及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 本论文专用术语注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 微纳气泡与超声诊疗 |
| 1.1.1 微纳气泡的声学响应 |
| 1.1.2 微纳气泡的诊疗应用 |
| 1.1.2.1 疾病超声影像增强诊断应用 |
| 1.1.2.2 疾病超声微气泡治疗应用 |
| 1.1.2.3 诊疗一体化应用 |
| 1.1.3 微纳气泡的制备方法 |
| 1.1.4 存在的限制与挑战 |
| 1.2 自由微纳气泡 |
| 1.2.1 自由微纳气泡的性能与应用 |
| 1.2.2 体相纳米气泡 |
| 1.2.3 自由纳米气泡的关键问题 |
| 1.3 基于气泡界面的自组装技术 |
| 1.4 本论文的选题背景及研究内容 |
| 1.4.1 论文选题背景和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 往复压差法制备自由纳米气泡 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验步骤与方法 |
| 2.3.1 往复压差法制备体相纳米气泡 |
| 2.3.2 基于往复压差法的机械化制备装置的构建 |
| 2.3.3 纳米气泡的表征 |
| 2.3.4 光学显微镜实时监控气泡变化 |
| 2.3.5 全反射红外光谱检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 纳米气泡的表征 |
| 2.4.2 纳米气泡形成的影响因素 |
| 2.4.3 纳米气泡浓度的调控 |
| 2.4.4 纳米气泡的稳定性 |
| 2.4.5 微气泡到纳米气泡的监测 |
| 2.4.6 红外光谱检测水中氢键变化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 自由纳米气泡的形成、破裂及稳定机理探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验步骤与方法 |
| 3.3.1 纳米气泡、液滴和颗粒的制备 |
| 3.3.2 纳米气泡的表征 |
| 3.3.3 暗场显微镜成像 |
| 3.3.4 纳米气泡的光学散射计算 |
| 3.3.5 羟基自由基检测 |
| 3.3.6 体外超声成像评价 |
| 3.3.7 基于图像的纳米气泡的运动分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含不同气体的纳米气泡表征 |
| 3.4.2 纳米气泡的光散射 |
| 3.4.3 微气泡到纳米气泡的动态演变 |
| 3.4.4 不同气体的微气泡收缩动力学 |
| 3.4.5 不同气体的纳米气泡运动分析 |
| 3.4.6 纳米气泡的破裂和自由基产生 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 自由气泡界面磷脂分子自组装制备包膜气泡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验步骤与方法 |
| 4.3.1 磷脂包膜气泡的制备 |
| 4.3.2 磷脂包膜气泡的理化表征 |
| 4.3.3 自由气泡界面磷脂分子自组装机理探究 |
| 4.3.4 体外超声成像评价 |
| 4.3.5 体内超声成像评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 自组装磷脂包膜气泡的设计,制备和表征 |
| 4.4.2 升温诱导的磷脂自组装聚集结构变化 |
| 4.4.3 磷脂分子在自由气泡界面的自组装 |
| 4.4.4 降温诱导的气泡磷脂壳层的相转变 |
| 4.4.5 自由气泡界面磷脂分子自组装制备包膜气泡机理 |
| 4.4.6 磷脂包膜气泡尺寸的调控及机理 |
| 4.4.7 体外超声成像 |
| 4.4.8 体内超声成像 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 磷脂包覆氙气纳米气泡的神经保护作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验步骤与方法 |
| 5.3.1 氙气纳米气泡的制备 |
| 5.3.2 氙气纳米气泡的表征 |
| 5.3.3 氙气含量的测定 |
| 5.3.4 氙气纳米气泡对PC12 细胞缺糖缺氧的保护作用 |
| 5.3.5 氙气纳米气泡对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 氙气纳米气泡的制备与表征 |
| 5.4.2 氙气的包覆量和体外稳定性 |
| 5.4.3 对缺糖缺氧PC12 细胞的保护 |
| 5.4.4 对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 5.4.5 对脑血液再通的影响 |
| 5.4.6 氙气纳米气泡的分布 |
| 5.4.7 组织病理切片结果 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文与申请的专利 |
| 致谢 |
四、Using laser confocal scanning microscope to study ischemia-hypoxia injury in rat brain slice（论文参考文献）
- [1]多酚化合物表面自组装生物活性纳米粒靶向治疗心脏病的研究[D]. 戚远通. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究[D]. 陈莎. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]δ-catenin相关的GluR2内化在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究[D]. 兰俊英. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]3巯基丙酮酸硫转移酶产生的硫化氢对缺血缺氧性损伤的脑血管内皮细胞保护作用及机制探讨[D]. 张芳. 安徽医科大学, 2020(04)
- [5]丹参多酚酸盐通过调控小胶质细胞对神经元损伤保护作用的研究[D]. 栾朋伟. 郑州大学, 2020(02)
- [6]ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制[D]. 蒋伟. 湖南大学, 2020
- [7]纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究[D]. 张姗. 新疆医科大学, 2020(03)
- [8]丝素蛋白水凝胶结合NSC对缺血缺氧脑损伤的修复及姜黄素的干预作用研究[D]. 韩朝. 大连医科大学, 2020(03)
- [9]咖啡因促进少突胶质细胞组蛋白乙酰化对缺血缺氧新生大鼠脑白质损伤的保护作用研究[D]. 刘娜. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]微纳气泡界面脂质分子自组装及应用研究[D]. 金娟. 东南大学, 2020(01)