导读:本文包含了细胞乏氧论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:牙周膜成纤维细胞,A20,骨分化
细胞乏氧论文文献综述
燕珂,叶宇,李璐,王晓茜[1]（2019）在《A20基于自噬调控乏氧刺激的牙周膜成纤维细胞破骨分化的研究》一文中研究指出目的:A20,NF-κB信号通路的抑制剂,但具通过调控自噬对破骨分化的作用尚未明确。研究目的是探究A20过表达/沉默通过调控自噬对乏氧刺激下人牙周膜成纤维细胞破骨分化能力的影响。方法:不同氧浓度(20%,10%,5%,2%)刺激hPDLCs,western-blot,PCR检测不同时间点A20,RANKL,OPG表达;A20过表达/沉默慢病毒转染hPDLCs,验证效率并检测RANKL,OPG表达;应用或不应用自噬抑制剂3-MA,2%氧体积分数培养A20过表达/沉默hPDLCs24h,western-blot,PCR,IF检测A20,RANKL,OPG,自噬相关基因ATGs(本文来源于《2019年中华口腔医学会牙周病学专业委员会牙周病与植体周病新分类·新理论·新技术高峰论坛会议手册及论文汇编》期刊2019-07-20）
赵丹,陈丹,唐洪,杨凯[2]（2019）在《乏氧微环境中癌相关成纤维细胞Caveolin-1过表达对于其能量代谢的影响》一文中研究指出目的探讨乏氧和常氧状态下Caveolin-1在癌相关成纤维细胞(C AFs)中的表达及其对代谢的影响。方法由口腔鳞癌癌周组织中提取、分离、鉴定和培养癌相关成纤维细胞,分别在常氧(21%O_2)和乏氧(0.5%O_2)状态下进行培养,通过电镜观察两种状态下CAFs细胞中线粒体的变化、溶酶体及自噬体的出现情况,同时通过线粒体特殊染色、膜电位检测、吸光度检测分析两种状态下CAFs细胞线粒体的形态、膜电位、ATP浓度以及培养基中葡萄糖、乳酸浓度,同时采用Westernblot技术检测两种状态下CAFs对Caveolin-1及自噬标记物LC3A/B、ATG16L、Beclin1,以及线粒体自噬标记物BNIP-3、BNIP-3L的表达情况。结果与常氧状态相比较,乏氧状态下CAFs细胞中线粒体缩小、功能减弱,部分有溶酶体和自噬体的出现,细胞ATP合成减少,同时培养基中葡萄糖浓度减少,乳酸浓度升高。乏氧状态下,Caveolin-1及上述自噬标记物、线粒体自噬标记物在CAFs表达明显增强。结论乏氧微环境可能通过上调CAFs Caveolin-1表达,促进其发生线粒体自噬,优先通过糖酵解进行能量代谢,将摄取的葡萄糖转化为乳酸供给肿瘤细胞所需的能量。(本文来源于《2019年中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会第十叁次全国口腔颌面-头颈肿瘤内科学术会议论文汇编》期刊2019-07-19）
陈雪[3]（2019）在《乏氧对脂多糖诱导的人牙周膜细胞炎症免疫反应的影响》一文中研究指出背景与目的:牙周病是常见的口腔疾病,是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一,但却往往被人们所忽视。牙周病的致病因素有很多,其中最主要的致病因素是菌斑生物膜,是由菌斑的细菌及其代谢产物作用于牙周组织从而激活宿主炎症免疫反应导致牙周组织破坏的一种炎症性疾病。当人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)受到致病菌及其代谢产物刺激时,hPDLCs自身可分泌多种细胞因子和化学介质参与局部免疫反应。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是公认的炎症启动因子,可通过刺激免疫细胞和局部邻近组织细胞增加炎症因子的表达,进而诱导宿主发生一系列免疫反应。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)与炎症、自身免疫疾病等密切相关,炎症免疫反应发生后,IL-6率先生成,参与牙周组织慢性炎症过程。白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)又称为趋化因子CXCL-8,是趋化因子家族的一种细胞因子。IL-8结合受体α(CXCR-1)和受体β(CXCR-2)通过趋化、聚集并激活中性粒细胞,发生脱颗粒作用释放溶酶体酶促进炎症介质的释放,而实现其对炎症免疫反应的调节,达到杀菌和细胞损伤的目的。TLR-2(Toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)是I型跨膜蛋白,属于模式识别受体,它们都在LPS激发的炎症免疫反应中起重要作用,是细菌破坏细胞的关键途径。当炎症发生时,局部炎症组织及细胞处于乏氧微环境中,因此在乏氧微环境下对牙周炎症的研究更接近牙周炎时真实的牙周组织微环境。目前,国内外关于乏氧和LPS分别对hPDLCs的影响的研究已经比较广泛和深入,但乏氧条件下研究LPS对hPDLCs免疫反应的影响鲜见报道。本实验旨在乏氧环境下培养经LPS诱导的hPDLCs,模拟真实情况下牙周炎症组织局部乏氧的病理模型,通过检测IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的表达情况分析乏氧对LPS诱导的hPDLCs炎症免疫反应的影响,以期为牙周病的治疗提供新思路。材料和方法:1、组织块法原代培养hPDLCs;2、取第4代hPDLCs,流式细胞术检测细胞分子表型对细胞进行鉴定;3、取第3代hPDLCs,CCK-8法检测细胞增殖情况;4、模型建立及实验分组:取第4代生长良好的hPDLCs随机分为4组:(A组)常氧+无LPS、(B组)常氧+LPS、(C组)乏氧+无LPS、(D组)乏氧+LPS。培养6h、12h、24h、48h后收集各组细胞,分别用Realtime-PCR检测IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表达;5、模型建立及实验分组:取第4代生长良好的hPDLCs随机分为4组:(A组)常氧+无LPS、(B组)常氧+LPS、(C组)乏氧+无LPS、(D组)乏氧+LPS。培养6h、12h、24h、48h后收集各组细胞及其上清液,分别用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay,ELISA)检测各组IL-6、IL-8的表达和流式细胞术检测各组TLR-2、TLR-4的表达。结果:1、组织块法体外培养成功获得hPDLCs;2、流式结果示:所培养细胞为间充质来源,符合成纤维细胞的生物学特性;3、CCK-8结果示:细胞生长呈“S”形,符合成纤维细胞生长规律;4、Realtime-PCR结果从基因水平上说明:与对照组相比,乏氧(1%02)或LPS刺激对hPDLCs炎症因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表达有显着促进作用,且乏氧(1%02)能增强LPS诱导的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4 mRNA的表达;5、ELISA和流式细胞术结果从蛋白水平上说明:与对照组相比,乏氧(1%02)或LPS刺激对hPDLCs炎症因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表达有显着促进作用,且乏氧(1%O2)能增强LPS诱导的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表达。结论:1、乏氧及脂多糖均可诱导hPDLCs炎症因子的表达。2、乏氧可增强脂多糖诱导的hPDLCs炎症因子表达。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-05）
王淼,袁冰,刘平,李贺伟,刘洋[4]（2019）在《γ分泌酶抑制剂对乏氧环境下骨肉瘤细胞增殖及侵袭力影响的实验研究分》一文中研究指出目的探讨乏氧状态下分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitors,DAPT)介导Notch1信号通路对骨肉瘤MG-63细胞系增殖、凋亡、侵袭、转移的影响及相关机制。方法以骨肉瘤细胞株MG-63为研究对象,分为正常组(NC)、乏氧组(Hypoxia)和含有DAPT的乏氧组作为实验组(Hypoxia+DAPT)。采用流式细胞仪检测处理后的细胞周期,CCK-8方法检测细胞的增殖能力,并使用Western Blot检测MG-63细胞株中Notch1、HIF-1、Hes-1蛋白的表达情况,通过Transwell实验来验证其转移能力。同时探讨DAPT在乏氧环境下对细胞增殖和细胞周期方面的影响,分析其介导的Notch1下调情况及其抑制乏氧对MG-63细胞的促增殖作用。结果与正常组相比较,乏氧组细胞的增殖能力及侵袭能力均较正常组有显着的提升,差异具有统计学意义(<0.05)。而实验组与乏氧组相比较,分泌酶抑制剂(DAPT)能显着降低其增殖及侵袭能力(<0.05)。Western Blot结果显示,与正常组相比,乏氧组和实验组均可上调Notch1、HIF-1、Hes-1相关蛋白的表达;但是与乏氧组对比,实验组可显着下调Notch1、HIF-1、Hes-1蛋白的表达水平(<0.05)。流式细胞仪结果显示:与正常组相比,乏氧组和实验组均可促进细胞由G1期转向G2期;而与乏氧组对比,实验组可显着抑制细胞由G1期转向G2期,使细胞周期停滞,差异具有统计学意义(<0.05)。增殖实验结果显示,与正常组相比,乏氧组和实验组均可促进细胞增殖;而与乏氧组对比,实验组可显着抑制细胞增殖,差异具有统计学意义(<0.05)。结论分泌酶抑制剂可通过下调Notch1通路显着抑制乏氧状态下骨肉瘤细胞株MG-63的增殖与侵袭,阻断Notch1表达可能是潜在的治疗骨肉瘤的机制之一。(本文来源于《生物骨科材料与临床研究》期刊2019年02期）
黄晶晶,卢乐,吉鸿,陆宏伟[5]（2019）在《乏氧环境下HIF-1α对肝癌细胞逆向分化影响的实验研究》一文中研究指出目的探讨体外乏氧环境下低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对诱导肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并维持恶性生物学行为的影响。方法采用免疫磁珠分选出HepG2细胞中的CD133阴性细胞,分为2个大组:转染组转染siRNA-HIF-1α以沉默HIF-1α基因的表达,空白对照组不转染任何siRNA片段。2类细胞分别进行常氧及乏氧条件培养,本实验共分4组。采用MTT、克隆形成实验及Transwell小室实验检测细胞的增殖和侵袭能力,采用Western blot法及RT-PCR法检测细胞中HIF-1α、CD133、CD90及CD44的mRNA及其蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示:4组细胞的增殖率随乏氧培养时间延长而增高;24 h及以后,与空白对照组相比,经siRNA-HIF-1α转染后,转染常氧组和乏氧组的细胞增殖率降低(P<0.05)。平板克隆实验结果显示:转染常氧组与转染乏氧组、空白对照常氧组与空白对照乏氧组比较其细胞形成克隆数的差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell小室实验结果显示:乏氧培养后,转染组与空白对照组相比,迁移至下室的细胞数目减少(P<0.05)。Western blot及RT-PCR结果显示:空白对照乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及其mRNA的表达水平均高于其余3组(P<0.05);经siRNA-HIF-1α转染后,转染乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及mRNA的表达水平均较转染常氧组和空白对照常氧组降低(P<0.05)。结论在乏氧环境下,低氧诱导因子HIF-1α可促进肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并增强其恶性生物学行为。(本文来源于《中国普外基础与临床杂志》期刊2019年01期）
何龙[6]（2018）在《乏氧微环境下Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞的影响及机制研究》一文中研究指出肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤,也居我国恶性肿瘤发病率及死因首位。根据病理类型不同,肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型,占肺癌总数的85%左右。随着近年来我国大气污染的恶化及吸烟人群的持续增长,肺癌发病率仍呈逐年升高趋势。虽然近年来某些肺癌亚型患者的治愈率和生存期有所提高,但其总体治疗效果仍不理想,迫切需要探寻影响非小细胞肺癌发生发展的相关因素和参与机制,为其治疗策略改进提供理论依据。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是恶性肿瘤无限增殖和复发的根源,近年来一直是肿瘤领域的研究热点;CSCs与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、治疗抵抗等多种恶性表型密切相关。研究表明,CSCs在非小细胞肺癌发生、发展及耐药等具有关键作用,针对肿瘤干细胞的治疗策略已成为肺癌等肿瘤治疗的重要发展方向之一。目前应用较多的肺癌CSCs标记物包括ALDH、CD133及ABCG2等。但是调控非小细胞肺癌CSCs比例、功能的具体机制尚不十分明确。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内的重要信号传导机制之一,参与调控机体的多种生理过程,其异常表达和调控参与多种疾病,特别是肿瘤的发生和发展过程。该通路因其启动蛋白WNT而得名,WNT是一种富含半胱氨酸的糖蛋白,当其与细胞膜表面的Frizzled家族跨膜蛋白受体结合后,即可激活经典的WNT/β-catenin信号通路,使得胞浆内的β-catenin得以稳定存在,部分β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定靶基因的表达。已有的研究证实,Wnt/β-catenin通路在肿瘤发生、肿瘤血管生成和肿瘤干细胞自我更新中均具有重要作用;但其在肿瘤微环境中对非小细胞肺癌不同病理类型CSCs的调控作用和参与因子相关研究尚少。乏氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一,其不仅影响肿瘤细胞本身的生物学行为,而且也可能会显着影响CSCs的多种特性,包括干细胞比例、侵袭转移能力及对药物的敏感性等。研究肿瘤乏氧微环境下CSCs的调控机制和参与分子,可更好的反应参与肿瘤局部CSCs特性的调控通路和机制,目前相关报道较少,并可为非小细胞肺癌恶性表型和治疗策略改进提供更为精确的理论依据。本课题研究了乏氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌(包括不同类型肺癌细胞:肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞)肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响;并对非小细胞肺癌患者临床病理标本Wnt/β-catenin通路表达、乏氧关键调控因子HIF-1α进行了检测,分析二者之间的相关性及与患者生存预后的关系,为体外研究的结果提供了进一步验证。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中广泛表达,其不仅在机体骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等正常干细胞自我更新中起到重要作用,而且也参与CSCs的干性维持及侵袭、治疗耐药等过程;但其表达与Wnt/β-catenin信号通路的关系尚不明确。因此,本课题也探讨了 Wnt/β-catenin信号通路是否能调控bFGF的表达,进而影响CSC所致的化疗耐药,以从bFGF角度探讨Wnt/β-catenin通路调控CSCs的参与因子和机制。第一部分乏氧微环境下Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响目的:乏氧是肿瘤微环境的重要特征,其可影响非小细胞肺癌的多种恶性生物学行为;该部分研究主要探讨肿瘤乏氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响。非小细胞肺癌主要包括肺腺癌和肺鳞癌等类型,大量基础和临床研究已经证实肺腺癌和肺鳞癌具有不同的生物学特性和基因/分子表达;因此,我们分别对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞进行了相关研究。方法:1.分别在常氧(21%O2、5%CO2)和乏氧(1%O2、5%CO2和94%N2混合气体)条件下在培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞;培养48 h后,提取细胞总蛋白,western blot检测β-catenin的表达改变;2.同上分别在常氧和乏氧条件下培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞,按照ALDEFLUORTM ASSAY试剂盒说明书要求处理和孵育细胞,流式细胞仪分别检测A549细胞和H520细胞中ALDH+细胞比例,研究乏氧对ALDH+细胞比例的影响;3.常氧条件下分别培养A549细胞和H520细胞,加入Wnt通路抑制剂XAV939处理细胞,western blot检测β-catenin的表达改变,并采用ALDEFLUORTM ASSAY检测其中ALDH+细胞比例改变;4.分别在常氧和乏氧条件下在培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞,通过Matrigel基质胶包被的Transwell小室系统检测乏氧对A549、H520细胞侵袭能力的影响;5.HIF家族基因(HIF1α、HIF2α等)是细胞对乏氧应答的关键调控基因。分别在常氧和乏氧条件下培养A549细胞和H520细胞,提取细胞RNA,qRT-PCR检测HIF1α、HIF2α mRNA的表达水平,western blot检测HIF1α蛋白水平的表达改变。6.在常氧条件下培养的A549细胞和H520细胞中加入特异性抑制剂抑制Wnt通路后,western blot检测HIF1α蛋白的表达。结果:1.分别在常氧和乏氧条件下培养肺腺癌A549细胞,检测Wnt/β-catenin信号通路的表达,发现乏氧培养48 h后β-catenin信表达显着下调:ALDEFLUO ASSAY检测表明,乏氧培养48 h后肺腺癌A549细胞中ALDH+细胞比例显着下降(P<0.05);2.而分别在常氧和乏氧条件下培养肺鳞癌H520细胞,western blot检测Wnt/β-catenin信号通路的表达则发现乏氧培养48 h后β-catenin信表达显着上调;ALDEFLUO ASSAY检测表明,乏氧培养48h后H520细胞中ALDH+细胞比例显着上升(P<0.05);这说明乏氧对肺腺癌和肺鳞癌ALDH+细胞比例具有不同的调控作用。3.常氧条件下在A549细胞和H520细胞中加入Wnt通路抑制剂XAV939后,β-catenin表达均显着下降;ALDEFLUO ASSAY检测结果表明,无论是A549细胞还是H520细胞,其中的ALDH+细胞比例则显着下降;4.Transwell侵袭试验检测乏氧对A549、H520细胞侵袭能力的影响,结果表明,肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞的侵袭能力均显着增强(P<0.05);5.乏氧显着上调A549细胞和H520细胞中HIF1α mRNA的表达,而HIF2α mRNA的表达常氧和乏氧条件下未见显着差异;western blot检测结果进一步证实HIF1α蛋白水平表达也显著增高;6.采用特异性抑制剂抑制Wnt通路表达后,HIF1α的表达也显著下降;这提示,乏氧和Wnt/β-catenin信号通路存在相互调控作用。结论:乏氧可显着下降肺腺癌A549细胞中β-catenin的表达,而且其中ALDH+细胞比例也显着下降;在肺鳞癌H520细胞中β-catenin的表达则显着上升,其ALDH+细胞比例却显着上升,这说明乏氧对肺腺癌和肺鳞癌ALDH+细胞比例具有不同的调控作用。在A549细胞和H520细胞中加入Wnt通路抑制剂抑制其激活后,β-catenin表达均显着下降,而且无论是A549细胞还是H520细胞中的ALDH+细胞比例则显着下降。乏氧显着促进肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞的侵袭能力。乏氧显着上调A549细胞和H520细胞中HIF1α mRNA和蛋白水平的表达,采用特异性抑制剂抑制Wnt通路表达后,HIF1α的表达下调,提示乏氧和Wnt/β-catenin信号通路存在相互调控作用。第二部分非小细胞肺癌患者病理组织β-catenin、HIF-1α表达相关性分析及对患者生存预后的影响目的:在晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织中检测β-catenin、HIF-1α的表达,统计学分析其表达的相关性;随访非小细胞肺癌患者生存预后,分析β-catenin表达对患者生存期的影响;该部分临床病理组织检测的分析结果,可为第一部分实验室研究的结果提供间接验证。方法:1.收集76例晚期非小细胞肺癌患者临床病理资料,包括患者性别、年龄、吸烟史、病理类型、分化程度、淋巴结转移情况等;随访其总生存期(Overall survival,OS);同时收集这些患者的病理组织标本;2.免疫组化检测76例晚期非小细胞肺癌患者病理组织β-catenin、HIF-1α的表达,利用卡方检验分析二者表达的相关性;3.利用Kaplan-Meier生存分析研究β-catenin表达与患者OS的相关性。结果:1.免疫组化检测结果发现,β-catenin在晚期非小细胞肺癌患者病理组织中具有较高的表达率(阳性率>85%),其表达与肿瘤分化程度有关,与其他临床病理因素无显着相关性。HIF-1α在非小细胞肺癌患者病理组织中有不同程度的表达,统计学分析未发现其与患者临床病理因素显着相关;2.Spearman检验分析表明,β-catenin表达与HIF-1α表达具有相关性(P<0.001);3.生存分析表明,β-catenin高表达的晚期非小细胞肺癌患者生存预后显着差于低表达组(P<0.01)。结论:1.在晚期非小细胞肺癌患者病理组织中可检测到不同程度的β-catenin和HIF-1α的表达,并且前者表达与TNM分期有关。2.统计学分析证实,β-catenin和HIF-1α表达之间具有相关性;3.β-catenin表达与患者生存预后有关,高表达的非小细胞肺癌患者OS均显着低于低表达者。4.非小细胞肺癌患者病理组织检测的结果进一步验证了第一部分体外研究的结果,也为非小细胞肺癌患者预后预测提供更多分子指标和依据。第叁部分Wnt/β-catenin通路调控bFGF表达对非小细胞肺癌细胞株肿瘤干细胞的影响目的:研究Wnt/β-catenin信号通路是否通过调控bFGF的表达影响非小细胞肺癌肿瘤干细胞特性(包括OCT-4表达、化疗耐药等)。方法:1.分别采用Wnt通路突变激活质粒pcDNA3-S33Y-β-catenin和对照质粒pcDNA3转染肺癌A549细胞,通过G418筛选转染成功的细胞;western blot检测结β-catenin的表达,验证是否成功建立了过表达β-catenin的细胞株;2.qRT-PCR和western blot检测bFGF在β-catenin过表达细胞株和对照细胞株的表达,探讨Wnt/β-catenin信号通路是否可调控bFGF的表达;3.采用siRNA干扰的方法敲减bFGF在A549细胞的表达,qRT-PCR和western blot验证敲减效果;4.siRNA敲减bFGF在A549细胞表达后,分别采用CCK-8试剂盒检测细胞活力和流式细胞术检测细胞凋亡的方法,探讨bFGF对A549顺铂敏感性(细胞活力抑制和诱导凋亡等)的影响;5.bFGF siRNA下调A549细胞bFGF表达后,克隆形成试验检测其对A549细胞克隆形成能力的影响;western blot检测其对CSCs关键调控基因OCT-4表达的影响。结果:1.质粒转染后western blot检测结果表明,与对照及A549细胞相比,β-catenin表达显着上调,这说明成功建立了 β-catenin过表达细胞A549细胞株及对照细胞株。2.与对照细胞株相比,β-catenin过表达细胞株bFGFmRNA水平和蛋白水平的表达均显着上调,这说明Wnt/β-catenin信号通路激活可促进bFGF的表达;3.bFGF siRNA明显抑制bFGF在A549细胞的表达,无论是mRNA水平还是蛋白水平;4.与对照siRNA处理组相比,bFGF siRNA明显增强不同浓度顺铂(2.5,5,and 10 μg/mL)对A549细胞的抑制作用。bFGFsiRNA并未显着影响A549细胞的凋亡率,但是其可显着促进顺铂所诱导的凋亡(26.67%± 2.59%vs.9.05%± 1.20%,P<0.05)。5.bFGFsiRNA下调A549细胞bFGF表达后,克隆形成试验检测发现,A549细胞克隆形成率显着下降(P<0.05),而且western blot结果表明OCT-4的表达也显着下调。结论:Wnt/β-catenin信号通路在非小细胞肺癌A549细胞显着促进bFGF的表达,而bFGF可降低A549细胞对顺铂的敏感性。同时,bFGF也促进A549细胞的克隆形成能力和OCT-4的表达。这说明Wnt/β-catenin信号通路可通过调控非小细胞肺癌bFGF的表达并进一步影响其克隆形成能力、化疗耐药及OCT-4表达等肿瘤干细胞特性。(本文来源于《山东大学》期刊2018-09-26）
程坦,郑杰灵,刘颖,谢国柱,袁亚维[7]（2018）在《草氨酸钠抑制乏氧鼻咽癌细胞CNE2血管紧张素Ⅱ生成提高放射敏感性》一文中研究指出目的探讨草氨酸钠对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。方法利用乳酸测定试剂盒和血管紧张素ⅡELISA试剂盒检测草氨酸钠对鼻咽癌细胞株CNE2乳酸和血管紧张素Ⅱ生成的影响;应用MTT细胞增殖实验检测草氨酸钠对乏氧CNE2细胞增殖能力的影响;利用克隆形成实验检测草氨酸钠对乏氧CNE2鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。结果草氨酸钠处理后CNE2细胞的乳酸以及血管紧张素Ⅱ生成减少,草氨酸钠有抑制乏氧CNE2细胞增殖的作用。草氨酸钠处理的乏氧CNE2细胞对射线的敏感度明显增加。结论草氨酸钠对乏氧CNE2鼻咽癌细胞有增殖抑制作用并显着提高了其放射敏感性,其机制可能与其抑制了CNE2细胞血管紧张素Ⅱ的生成有关。(本文来源于《实用医学杂志》期刊2018年12期）
瞿潇[8]（2018）在《乏氧及氧化应激在非小细胞肺癌预后及治疗中的作用研究》一文中研究指出恶性肿瘤对人类的健康和生命产生了巨大威胁,是中国乃至全世界主要的人口死亡原因之一。根据我国最新癌症统计学数据,肺癌是当今中国死亡率最高的恶性肿瘤,晚期肺癌五年生存率不足15%。根据病理类型,肺癌可分为非小细胞肺癌(Non-small-cell Lung Cancer,NSCLC)及小细胞肺癌(Small-cell Lung Cancer,SCLC),其中NSCLC是肺癌的主要组成部分,占肺癌总数的80-85%。由于缺乏典型的临床表现,NSCLC在诊断初期往往已经是晚期。近年来,尽管NSCLC的治疗在手术、放疗及化疗中都取得了一定的进展,但五年生存率仍较低。乏氧是恶性实体瘤的重要生物学特性之一。近二十年来的临床研究已经明确证实几乎所有恶性实体瘤中都存在一定范围的乏氧区域,是局部晚期实体瘤的特征性病理生理特征之一。乏氧在肿瘤中产生的原因是多样化的,但其根源在于氧气供给不足以及耗氧量增加。在正常组织中,氧气的供给与组织代谢的需求处于平衡状态,但在恶性肿瘤中,由于没有完善的血供以及肿瘤的高代谢状态,最终导致了肿瘤乏氧。同时,由于肿瘤本身以及化疗相关性贫血,进一步使血液中氧含量下降以及肿瘤供氧不足。乏氧会对肿瘤细胞产生巨大影响,比如会提高肿瘤基因组不稳定性、促进肿瘤血管生成、引起肿瘤转移、导致放化疗耐受以及产生不良预后等。与乏氧相对应的则是氧化应激,但二者之间并不矛盾。氧气是线粒体通过氧化磷酸化产生叁磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)所必须的,同时,由于氧气分子活泼的化学活性,极易形成活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)。当细胞处于乏氧状态时,由于能量及氧气缺乏,线粒体复合体III中ROS产生急剧增加。ROS是细胞代谢中的正常产物,主要包括超氧化物、过氧化物和氢氧自由基等。线粒体代谢过程中电子传递链是ROS的主要来源。ROS在肿瘤的发生发展中具有重要作用,在正常组织中,细胞内ROS水平通过氧化还原机制控制在平衡状态,而肿瘤细胞内的ROS产生速度远远高于正常细胞。一定水平的ROS会增加肿瘤细胞突变频率,激活增殖相关信号通路,促进肿瘤进展。尽管ROS在一定程度上促进了肿瘤的发生发展,但当ROS水平过高时,则会导致氧化应激而对肿瘤细胞产生致命性损伤,从而成为肿瘤治疗的靶点之一。氧化还原水平的平衡取决于ROS的产生速率与清除系统的清除能力。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白等多种ROS清除剂在氧化还原稳态中发挥重要作用。在前期关于乏氧的研究中,我们发现乏氧诱导因子-1的表达与肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1)信号通路密切相关。LKB1是细胞内维持能量及氧化还原稳态的关键分子,LKB1单独突变被认为不能诱导肺癌的出现,但KRAS-LKB1共突变(KL肿瘤)则会诱导肺腺癌、鳞癌或大细胞癌。在关于KRAS肿瘤的研究中,曾有学者提出将KRAS肿瘤根据共突变类型分成叁个亚类,KRAS-LKB1共突变是其中重要的一种亚型。KL肿瘤比KRAS突变肿瘤(K肿瘤)生长更快,更容易发生转移,而KL肿瘤通常合并有KEAP1的共突变。KEAP1是细胞氧化应激反应中的重要分子,作为E3泛素连接酶的适配蛋白,正常情况下KEAP1在细胞质中结合到NRF2上并诱导其泛素化,通过蛋白酶体途径降解NRF2,进而影响抗氧化相关基因转录,其中最重要的是谷氨酰胺代谢相关通路基因表达的改变。我们研究发现LKB1突变肿瘤抗氧化应激能力增强,这可能与LKB1突变合并KEAP1突变或NRF2上调进而引起谷氨酰胺代谢增强密切相关。谷氨酰胺的代谢在肿瘤的进展过程中非常关键,其重要性主要体现在其与葡萄糖一样,能够为肿瘤细胞的生长提供大量的ATP,并且是生成细胞内主要还原产物GSH的前体氨基酸。正常细胞及肿瘤细胞均需利用葡萄糖及谷氨酰胺,但需求量存在很大差别。肿瘤细胞对谷氨酰胺的需求远高于正常细胞。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)催化作用下形成谷氨酸是谷氨酰胺代谢的首要步骤。目前,GLS抑制剂已经进入临床I期实验,但并非对所有患者均有效,寻找合适的生物标记物指导GLS抑制剂的临床应用,对该药在临床上的广泛应用至关重要。目前GLS抑制剂的作用机制仍不清楚。根据谷氨酰胺在细胞中的作用,我们推测GLS抑制剂能够诱导能量应激及氧化应激,进而起到抗肿瘤作用。鉴于LKB1在肿瘤细胞中维持能量及氧化还原稳态中的重要作用,我们进一步探索了LKB1及其他突变对GLS抑制剂抗肿瘤作用的影响。第一部分 红细胞相关指数对非小细胞肺癌患者预后影响的研究[研究目的]1.以乏氧诱因为出发点,分析NSCLC患者术前红细胞相关指数对患者预后的影响;2.通过多因素分析,寻找红细胞相关指数中潜在的NSCLC独立预后因子;3.探索该指标与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。[研究方法]1.入组患者:本研究选取了从2006年1月到2009年12月在山东大学附属省立医院胸外科行肺癌根治术的患者,根据入组条件筛选患者入组。2.资料收集:收集患者的姓名、性别、血常规检查(入院后首次检查结果为准)、吸烟史、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移个数、术式等信息。通过山东大学附属省立医院病案管理系统获取患者临床信息及联系方式。通过电话回访的方式进行随访。3.统计方法:研究首要终点为患者总生存期(Overall Survival,OS),次要研究终点为无进展生存期(Recurrence Free Survival,RFS)。Kaplan-Meier法分析单因素对患者预后的影响并绘制生存曲线。通过log-rank时序检验比较两组之间的差异。通过受试者工作特征曲线比较不同指标对预后的预测能力并确定最佳界值。通过χ2检验(必要时使用Fisher确切检验)或t检验分析红细胞相关指数与临床病理特征之间的关系。预后因子的多因素分析通过Cox风险回归模型进行。单因素分析中p<0.05的变量进入多因素分析。当p<0.05时认为具有统计学差异(双侧检验)。[研究结果]1.患者基本特征:本研究共纳入患者649例,男性患者456例,女性患者193例。在患者的病理分期分布中,早期患者居多,Ⅰ/Ⅱ期患者占研究总人数的72.9%,Ⅲ期患者占27.1%,无Ⅳ期患者入组;2.单因素分析:患者的性别、年龄、术式、肿瘤分化程度、N分期、T分期、肿瘤大小、血红蛋白(Hemoglobin,HGB)、红细胞压积(Hematocrit,HCT)、平均红细胞体积(Mean Corpuscular Volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MeanCorpuscularHemoglobin,MCH)以及平均红细胞血红蛋白浓度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)与患者预后相关。红细胞相关指数中,较高水平的HGB、HCT、MCHC、MCV以及MCH与NSCLC患者较好的OS相关。同时,在对RFS的研究中,较高水平的MCH、MCV以及MCHC与较好的RFS也密切相关,但HGB与HCT对RFS影响无统计学意义;3.多因素分析:在利用其它明确预后因子校正后,只有MCHC既是OS的独立预后因子(p=0.032),又是RFS的独立预后因子(p=0.010)。MCV仅仅是OS的独立预后因子(p=0.018),但不是RFS的独立预后因子(p=0.059)。其它红细胞相关指标,如HCT、HGB以及MCH等仅在单因素分析中有意义,但在多因素分析中没有意义,证明这些预后因子并非独立预后因子;4.MCHC与临床病理因素的相关性分析:低MCHC水平与男性(p=0.02)、较高吸烟指数(p=0.002)、较高T分期(p=0.018)以及较大肿瘤体积(p=0.004)密切相关。[研究结论]1.单因素分析中,MCHC、MCH及MCV均对NSCLC患者OS及RFS有影响,但HGB、HCT仅影响患者OS;2.在非贫血NSCLC患者中,MCHC是预测OS及RFS的独立预后因子,MCV是预测OS的独立预后因子,但不是预测RFS的独立预后因子;3.低MCHC水平与男性、较高吸烟指数、较高T分期以及较大肿瘤体积密切相关。第二部分 能量及氧化应激对KRAS突变NSCLC治疗作用研究[研究目的]1.LKB1与KEAP1/NRF2在维持细胞内能量及氧化还原稳态中的作用;2.KEAP1/NRF2通路在LKB1缺失NSCLC中对能量及氧化还原稳态的调控作用;3.LKB1及KEAP1/NRF2对谷氨酰胺代谢的调控及各突变类型细胞对谷氨酰胺的依赖性;4.GLS抑制剂对NSCLC治疗作用;5.LKB1及KEAP1/NRF2通路对GLS抑制剂抗肿瘤作用的影响。[研究方法]1.利用肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据对KRAS突变NSCLC进行共突变分析,利用基因富集分析(Geneset Enrichment Analysis,GSEA)研究KEAP1突变对NSCLC可能的影响;2.利用慢病毒感染或CRISPR/cas9构建稳定过表达或敲除细胞系(LKB1及KEAP1过表达和KEAP1敲除),利用siRNA敲除NRF2;3.利用磺酰罗丹明B细胞染色法、克隆形成实验及CellTiter-Glo检测细胞增殖或细胞活力,利用BrdU及PI法检测细胞周期,利用AnnexinV/7-AAD检测细胞凋亡,利用DCFDA检测细胞ROS水平,利用蛋白质免疫印迹检测蛋白表达,利用ATPlite检测细胞内ATP水平,利用相应试剂盒检测细胞内各种代谢产物含量,利用2-NBDG检测细胞葡萄糖摄取水平。[研究结果]1.共突变分析显示,在NSCLC中,KRAS与LKB1及LKB1与KEAP1之间存在明显共突变;2.LKB1能够维持肿瘤细胞能量及氧化还原稳态,LKB1缺失细胞对能量应激敏感但对氧化应激耐受;3.LKB1可以通过KEAP1非依赖性途径调控NRF2的表达;4.LKB1及KEAP1共同调控谷氨酰胺代谢及细胞对谷氨酰胺的依赖性;5.GLS抑制剂CB-839及IACS-006274具有良好的抗肿瘤活性,能够通过周期抑制引起肿瘤细胞增殖抑制,但不能诱导肿瘤细胞凋亡;6.GLS抑制剂能够诱导肿瘤氧化应激及能量应激,且其肿瘤抑制作用能被丙酮酸及还原剂所挽救;7.GLS抑制剂可以完全抑制KRAS-LKB1-KEAP1肿瘤细胞的增殖,部分抑制KRAS-LKB1突变或KRAS-KEAP1突变肿瘤细胞的增殖,但几乎不能抑制KRAS单独突变肿瘤细胞的增殖。[研究结论]1.LKB1突变肿瘤能够通过KEAP1突变或KEAP1非依赖途径诱导上调NRF2的表达,并产生对谷氨酰胺的依赖;2.GLS抑制剂发挥抗肿瘤作用是通过诱导能量及氧化应激作用而产生的;3.GLS抑制剂对KRAS-LKB1-KEAP1共突变肿瘤效果最好,可能成为GLS抑制剂临床用药的生物标记物。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-03）
俞远东[9]（2018）在《乏氧微环境在促进乳腺癌肿瘤再生细胞增殖中的作用及其机制研究》一文中研究指出第一部分乏氧微环境对乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的影响目的:肿瘤干细胞(CSCs)是一群具自我更新,多能分化及启动体内肿瘤生长潜能等干细胞特性的肿瘤细胞,也是肿瘤发生、发展、治疗抵抗和治疗后复发的关键驱动因素。乏氧是调节肿瘤干细胞自我更新的关键微环境因子,同时也可以使肿瘤干细胞富集,但是氧是否可以直接促进肿瘤干细胞的增殖并不清楚。本部分研究基于叁维软纤维蛋白基质胶(3D fibrin)分离筛选出乳腺癌肿瘤干细胞(定义为肿瘤再生细胞,TRCs),利用血管内皮生长因子抑制剂构建肿瘤乏氧模型,探讨体内外乏氧对肿瘤干细胞增殖的影响。方法:(1)使用苹果酸舒尼替尼构建肿瘤乏氧模型;观察两组肿瘤体积的大小,免疫荧光染色检测肿瘤组织内的乏氧区域及血管分布情况;(2)使用流式细胞仪从乳腺癌肿瘤组织中分选出ALDH高表达及低表达的肿瘤细胞,并将其接种至叁维软纤维蛋白基质胶中,观察比较ALDH~+和ALDH~-细胞形成的克隆数目。(3)Real time PCR检测两组肿瘤组织中干性基因的表达(ALDH1A1、OCT4、KLF4、SOX2),Western blot检测ALDH1A1、PCK2的蛋白表达水平。(4)利用BrdU免疫荧光染色观察两组肿瘤组织中肿瘤干细胞的增殖情况。(5)将MCF-7、BT474及人原代乳腺癌TRCs分别置于常氧(21%O_2)和乏氧(1%O_2)的条件下培养6天,统计克隆体积及克隆数量;(6)利用CoCl_2模拟乏氧,观察不同浓度CoCl_2对MCF-7 TRCs克隆体积及数量的影响;(7)利用BrdU染色,观察两组细胞的增殖,同时利用PI和AnnexinV双染检测其凋亡;(8)采用Real time PCR检测干性基因在两组细胞中的表达差异。(9)将不同数量的常氧与乏氧MCF-7 TRCs接种于NOD-SCID小鼠乳腺垫下,观察两组的成瘤率及成瘤时间的差异。结果:(1)舒尼替尼处理组肿瘤体积明显缩小、乏氧区域明显增多,CD31染色显示血管分布减少。(2)ALDH~+肿瘤细胞形成的克隆数目显着高于ALDH~-的肿瘤细胞;(3)舒尼替尼处理组干性基因表达水平明显升高,ALDH蛋白表达上调,PCK2蛋白表达下调。(4)舒尼替尼处理组乏氧区域内ALDH及BrdU表达升高。(5)在乏氧情况下,MCF-7、BT474及人原代乳腺TRCs克隆体积明显增大。(6)在一定的浓度范围内,随着CoCl_2浓度的增加,MCF-7 TRCs克隆体积逐渐增大。(7)与常氧对照相比,乏氧组MCF-7 TRCs显着增加DNA合成(S期)。(8)乏氧组肿瘤干性基因(CD133、OCT4、KLF4、ALDH、SOX2)的表达明显高于常氧组。(9)乏氧组的成瘤能力显着高于常氧组。结论:乏氧微环境可以明显促进乳腺癌肿瘤再生细胞的增殖,诱导其肿瘤干细胞表型的表达,同时明显增强乳腺癌肿瘤再生细胞在体内的致瘤性。第二部分乏氧微环境介导的TCA循环重塑与ROS生成的机制研究目的:通过分析TCA循环中间代谢产物的变化,探索乏氧介导ROS升高的机制;进一步探究ROS促进乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的机制。方法:(1)在常氧和乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7以及人原代乳腺癌肿瘤再生细胞(TRCs)中的ROS水平,检测乏氧情况下经ROS清除剂NAC处理后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平;(2)乏氧情况下,经不同浓度NAC和有氧情况下不同浓度H2O2处理后,观察MCF-7 TRCs的克隆体积;(3)乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7及MCF-7 TRCs细胞内ROS水平,同时在2D培养的MCF-7细胞中,加入不同浓度NAC,计数检测MCF-7细胞的增殖状况;(4)Western blot检测MCF-7及人原代乳腺癌TRCs中NF-κB和Akt的表达及NAC处理后NF-κB和Akt磷酸化水平的变化;(5)MCF-7 TRCs经NF-κB和Akt抑制剂处理后,Western blot检测NF-κB和Akt磷酸化水平,并观察MCF-7 TRCs的克隆体积的变化;(6)13C标记的葡萄糖处理MCF-7 TRCs后LC/MS/MS检测TCA循环的代谢变化;(7)Western blot检测TCA循环限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达;(8)使用si RNA沉默MDH2、IDH3G后,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化,同时,使用ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;(9)使用si RNA沉默IDH3G,同时加入不同浓度的H2O2,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化;(10)LC/MS/MS检测TCA循环中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸的含量;(11)使用不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富马酸二甲酯(DMF)和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;(12)常氧乏氧情况下,使用LC/MS/MS检测MCF-7 TRCs细胞内GSF含量;(13)在常氧与乏氧情况下,使用NADPH及GSH试剂盒检测MCF-7 TRCs胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比值;(14)GSH-MEE处理乏氧的MCF-7 TRCs后,使用NADPH及ROS荧光探针检测细胞内NADPH/NADP+及ROS水平;(15)加入不同浓度GSH-MEE处理MCF-7 TRCs后,观察克隆体积变化;(16)使用si RNA沉默IDH3G后,检测GSF的含量变化及细胞内NADPH/DNAP+的比值。结果:(1)乏氧情况下,MCF-7、人原代乳腺癌TRCs中ROS含量升高,经NAC处理后ROS含量下降,且呈浓度梯度依赖;(2)乏氧情况下加入NAC清除ROS后,有效阻碍了TRCs的生长;反之,常氧条件下加入低浓度的H2O2可促进MCF-7 TRCs的生长;(3)常规2D培养的MCF-7细胞在乏氧条件下具有更高的ROS水平,NAC处理降低ROS水平后,乏氧所致的生长迟缓得到明显恢复。(4)乏氧导致MCF-7 TRCs中NF-κB和Akt磷酸化水平升高,加入NAC后磷酸化水平受抑制;(5)使用NF-κB和Akt抑制剂后,MCF-7 TRCs NF-κB和Akt磷酸化减弱,增殖明显被抑制;(6)13C葡萄糖同位素示踪试验显示乏氧时MCF-7 TRCs的TCA循环明显减慢;(7)乏氧时,MCF-7 TRCs中TCA循环的限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达均下调;(8)沉默MDH2后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平升高且克隆体积增大;而沉默IDH3G后细胞内ROS水平降低,克隆体积明显缩小;(9)H2O2可以逆转沉默IDH3G后克隆体积的缩小;(10)乏氧时,TCA循环的中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸均升高,且延胡索酸及苹果酸升高尤为明显;(11)不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富马酸二甲酯(DMF)和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,仅DMF使细胞内ROS水平升高且与浓度呈正比;(12)与常氧相比,乏氧MCF-7 TRCs细胞内GSF比例升高且胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比例均降低。(13)GSH-MEE处理乏氧MCF-7 TRCs后,细胞内NADPH/DNAP+升高,ROS水平降低,阻碍了乏氧对于TRC生长的促进作用;(14)琥珀酰化谷胱甘肽的升高以及NADPH/NADP+的降低可通过IDH3G补救。结论:乏氧导致TCA循环流动减慢,致使中间代谢产物延胡索酸堆积,而延胡索酸积累则导致琥珀酰化谷胱甘肽的形成,在GSF的形成过程中消耗了GSH及NADPH最终导致MCF-7 TRCs内的ROS水平增加。同时,ROS水平升高激活信号分子NF-κB和Akt,促进人乳腺癌TRC的生长。第叁部分HIF-1α介导的PCK2下调在乳腺癌TRCs TCA循环重塑中的作用目的:以乳腺癌MCF-7细胞为模型,探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK2)的下调表达对肿瘤再生细胞(TRCs)TCA循环中间代谢物(草酰乙酸、延胡索酸)的影响以及导致乏氧乳腺癌TRC中的延胡索酸积累的原因。同时进一步探究乏氧情况下PCK2下调表达的分子机制.方法:(1)乏氧情况下,Western blot检测MCF-7 TRCs中PCK2的表达情况;(2)使用四环素诱导的PCK2过表达系统,检测PCK2高表达后乳腺癌TRCs中延胡索酸,琥珀酰化谷胱甘肽(GSF)和ROS水平以及NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;(3)利用OAA检测试剂盒检测有氧、乏氧情况下及PCK2高表达后OAA含量的变化;(4)利用同位素标记的13C葡萄糖处理MCF-7 TRCs后,使用LC/MS/MS检测PCK2过表达后TCA循环的流动情况;(5)Western blot检测MCF-7 TRCs中HIF的表达,同时沉默或过表达HIF-1α后检测PCK2蛋白的表达水平;(6)利用同位素标记的13C检测HIF-1α沉默后TCA循环的流动情况;(7)UCSC基因组浏览器和JASPAR分析PCK2的启动子区域是否存在HIF-1α结合位点,并用染色质免疫共沉淀技术进一步验证;(8)利用PCK2启动子萤光素酶测定荧光素酶的表达,以确定HIF-1α与PCK2之间的调控关系;(9)使用富马酸二甲酯(DMF)处理缺氧的MCF-7 TRCs,Western blot检测HIF-1α及PCK2的表达;结果:(1)乏氧时,MCF-7 TRCs的PCK2表达下调;(2)过表达PCK2后,延胡索酸、GSF和ROS水平降低,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值增加;(3)乏氧时,MCF-7 TRCs细胞内OAA含量升高,PCK2过表达后OAA含量下降;(4)乏氧时,PCK2过表达后,TRCs的TCA循环加速,m+2和m+4形式的柠檬酸,α-酮戊二酸,延胡索酸和苹果酸比例升高;(5)常氧和乏氧乳腺癌TRCs均表达HIF-2α,而HIF-1α仅在乏氧的TRCs中显着上调。si RNAs沉默HIF-1α时,PCK2表达上调,过表达HIF-1α后,PCK2表达下调;(6)HIF-1α沉默后促进TCA循环的流动;(7)UCSC基因组浏览器和JASPAR分析揭示在PCK2的启动子区域存在多个HIF-1α的结合位点,并且Chip-PCR测定表明HIF-1α可以直接结合到PCK2的启动子区;(8)PCK2启动子萤光素酶测定显示,HIF-1α敲低增加萤光素酶的活性,HIF-1α过表达降低萤光素酶活性;(9)富马酸二甲酯(DMF)处理乏氧乳腺癌TRCs后,HIF-1α的表达增强,且PCK2表达降低。结论:PCK2下调导致的OAA积累阻碍了TCA循环的碳流动并导致乏氧乳腺癌TRCs中的延胡索酸积累;缺氧诱导的HIF-1α负调节PCK2表达,延胡索酸积累进一步加强了这种反馈。(本文来源于《华中科技大学》期刊2018-05-01）
肖华光[10]（2018）在《塞来昔布对乏氧鼻咽癌CNE-2细胞放疗增敏作用的研究》一文中研究指出目的:本实验旨在探讨塞来昔布对乏氧鼻咽癌CNE-2细胞放疗增敏作用及初步机制的研究。方法:以鼻咽癌CNE-2细胞为研究对象,选处于对数生长期的细胞进行实验:(1)四唑盐比色法(MTT)实验检测氯化钴(Co Cl2)对鼻咽癌CNE-2细胞增殖能力的影响,选出适宜的药物浓度诱导乏氧CNE-2细胞;(2)MTT实验检测塞来昔布对乏氧鼻咽癌CNE-2细胞增殖能力的影响,选出适宜的药物浓度;(3)将实验分为常氧组、乏氧组及乏氧塞来昔布组,克隆形成实验检测塞来昔布作用后乏氧CNE-2细胞的放射敏感性变化;(4)将实验分为常氧对照组、乏氧对照组、乏氧放疗组、常氧放疗组及乏氧塞来昔布放疗组,流式细胞仪(FCM)检测塞来昔布联合放疗对乏氧CNE-2细胞细胞周期和凋亡的影响。结果:(1)Co Cl2作用CNE-2细胞后24h及48h的IC50值分别为521.5umol/l、470.1umol/l;在48小时内,与空白对照组相比,50umol/l、100umol/l的Co Cl2作用于CNE-2细胞后,CNE-2细胞的抑制率无明显差别(P>0.05),150umol/l、200umol/l的Co Cl2对CNE-2细胞的抑制率有明显差别(P<0.05)。选择100umol/l(接近于20%IC50)浓度的Co Cl2用于实验诱导乏氧。(2)塞来昔布作用于乏氧CNE-2细胞24h及48h后显示:塞来昔布抑制乏氧CNE-2细胞的增殖,呈时间、浓度的依赖性。24h及48h的IC50值分别为38.9ug/ml、36.02ug/ml。选择10ug/ml浓度(低于IC50值的2个浓度)的塞来昔布用于实验。(3)克隆形成实验表明:在0、2、4、6Gy照射后,乏氧放疗组较常氧放疗组存活分数(SF)增高(P<0.05)。乏氧塞来昔布放疗组较乏氧放疗组存活分数(SF)降低(P<0.05)。构建单击多靶模型拟合细胞存活曲线,常氧组、乏氧组及乏氧塞来昔布组D0、Dq、N分别为(2.82,2.85,2.22)、(1.75,2.05,1.35)、(1.857,2.051,1.833)。相对于乏氧放疗组而言,乏氧塞来昔布放疗组的放射增敏比(SER)为1.28。(4)流式细胞仪检测结果表明:比较常氧对照组、乏氧对照组、乏氧放疗组、常氧放疗组及乏氧塞来昔布放疗组,细胞周期G0-G1分布逐渐增加,细胞周期S期分布逐渐减少,凋亡率增加(P<0.05)。结论:1、塞来昔布能抑制乏氧鼻咽癌CNE-2细胞的增殖。2、塞来昔布可增强乏氧鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性。3、其机制可能与塞来昔布抑制乏氧鼻咽癌CNE-2细胞G0-G1期阻滞及诱导乏氧CNE-2细胞凋亡有关。(本文来源于《南华大学》期刊2018-05-01）
细胞乏氧论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的探讨乏氧和常氧状态下Caveolin-1在癌相关成纤维细胞(C AFs)中的表达及其对代谢的影响。方法由口腔鳞癌癌周组织中提取、分离、鉴定和培养癌相关成纤维细胞,分别在常氧(21%O_2)和乏氧(0.5%O_2)状态下进行培养,通过电镜观察两种状态下CAFs细胞中线粒体的变化、溶酶体及自噬体的出现情况,同时通过线粒体特殊染色、膜电位检测、吸光度检测分析两种状态下CAFs细胞线粒体的形态、膜电位、ATP浓度以及培养基中葡萄糖、乳酸浓度,同时采用Westernblot技术检测两种状态下CAFs对Caveolin-1及自噬标记物LC3A/B、ATG16L、Beclin1,以及线粒体自噬标记物BNIP-3、BNIP-3L的表达情况。结果与常氧状态相比较,乏氧状态下CAFs细胞中线粒体缩小、功能减弱,部分有溶酶体和自噬体的出现,细胞ATP合成减少,同时培养基中葡萄糖浓度减少,乳酸浓度升高。乏氧状态下,Caveolin-1及上述自噬标记物、线粒体自噬标记物在CAFs表达明显增强。结论乏氧微环境可能通过上调CAFs Caveolin-1表达,促进其发生线粒体自噬,优先通过糖酵解进行能量代谢,将摄取的葡萄糖转化为乳酸供给肿瘤细胞所需的能量。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
细胞乏氧论文参考文献
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