俞虹（浙江省义乌中心医院322000）
【中图分类号】R512.6+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）31-0012-03
【摘要】目的检测慢性不同类型乙肝患者外周血淋巴与单核细胞表面CD40、CD40L的表达，评价患者的细胞免疫状态，为临床治疗提供指导。方法流式细胞仪测定慢性乙肝与肝硬化患者单核细胞与淋巴细胞表面CD40、CD40L表达的百分率。结果慢性乙肝组外周血淋巴与单核细胞表面CD40、CD40L表达率明显低于正常对照组（P<0.05），肝硬化组明显低于正常对照组（P<0.05）慢性乙肝组与肝硬化组无显著差异（均有P＞0.1）。HBV感染者淋巴、单核细胞表面CD40和CD40L的表达之间存在正相关（P均＜0.01）结论HBV感染者外周血淋巴与单核细胞表达CD40、CD40L低下，检测外周血CD40、CD40L-的表达可评估患者的细胞免疫状态，为临床的抗病毒治疗提供新思路。
【关键词】乙肝病毒细胞免疫CD40CD40L特异性杀伤T细胞
HBV感染主要通过机体对病毒感染细胞的杀伤而导致肝细胞的损害，HBV特异性杀伤T细胞作用被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制。机体对病原体的无特异性免疫应答机理十分复杂，涉及抗原递呈细胞对抗原的识别、淋巴细胞的功能及共刺激分子的第二信号等诸多因素[1]。CD40-CD40L是免疫细胞间重要的信号传导途径。我们检测外周血淋巴与单核细胞表面CD40、CD40L的表达情况，了解HBV感染者的细胞免疫状态，以期为临床治疗提供新思路。
一材料方法
1.病例资料
患者组：经临床确诊的慢性乙肝患者与肝硬化患者标本来自义乌中心医院感染科病房诊断全部符合2001年“中西医结合肝病杂志”修订的诊断标准，入选前未经过免疫治疗及抗病毒治疗，并排除其他肝炎病毒的混合感染。慢性乙肝患者共28例，男26例女2例，平均年龄31.4岁，其中轻度8例、中度12例、重度8例。肝硬化患者15例，男12例女3例，平均年龄51.7岁。
正常对照组：健康者标本来自义乌市中心医院检验中心体检者，为健康，肝功能正常“乙肝三系两对半”阴性的成年人，年龄，性别与患者组均有可比性。其中CD40、CD40L的对照25例。
2.主要试剂和仪器
CD40、CD40L及阴性对照浓缩液等单克隆抗体为PE标记的鼠抗人IgG1，均为ANCELL公司产品。
3.实验方法
（1）标本采集
无菌操作采集清晨空腹状态下的正常体检者、慢性乙肝患者及肝硬化患者外周血2-3ml，EDTA-K2抗凝。受检者均于入院四天内采血。
（2）CD40、CD40L标记的制备
单抗稀释液的配制：20ulCD40、CD40L及其阴性对照浓缩液加220ulCD40、CD40L专用PBS缓冲液（1：12）稀释，混匀，避光，2-4°C冰箱保存。20ulCD40、CD40L稀释液及其阴性对照稀释液各加50ulEDTA-K2抗凝全血,避光，室温保存15min，Q-PREP溶血仪溶血。每份标本都做测定管和阴性对照管。
（3）流式细胞仪检测
CoulterEpicsXL流式细胞仪开机预热30min后，用Flowcheck荧光微球进行光路流路校正，将HPCV调节在2%以内，前向和侧向散射信号采用线性放大，而荧光信号采用对数放大。根据前向散射光（FS）和侧向散射光（SS），将待测细胞分为淋巴、单核、中性粒三群，以淋巴、单核细胞设门调非特异性结合的阴性对照百分率在1%左右，每次收集10000个细胞，检测淋巴、单核细胞表面表达CD40、CD40L的结果，以百分率（%）表示。
4.统计学分析
计量资料用均数±标准差表示（x±s）表示。所测数据采用微机全部输入SPSS10.0软件分析，运用方差分析，两样本T检验及直线相关分析，P<0.05差异有显著性。
二结果
1.慢性乙肝与肝硬化患者淋巴、单核细胞表面CD40+、CD40L+表达率的测定。
表1慢性乙肝、肝硬化患者外周血CD40+、CD40L+表达率的的百分率的比较
结果显示，慢性乙肝组淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L的百分率低于正常对照组（P<0.05），肝硬化组也低于正常对照组（P<0.05）。慢乙肝与肝硬化患者间淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L表达的百分率无显著差异，均有P＞0.1。
2.慢性乙肝轻、中、重度及肝硬化患者外周血淋巴、单核表面CD40+、CD40L+表达率测定。
表3慢性乙肝轻、中、重度及肝硬化患者外周血CD40+、CD40L+表达率的的百分率的比较。
上表反映慢性不同类型乙肝患者外周血淋巴、单核CD40、CD40L的表达无明显差异，P值均＞0.05。
3.HBV感染者外周血淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L表达相关性比较。
HBV感染者外周血淋巴与单核细胞表面CD40、CD40L表达相关性分析表明，淋巴细胞、单核细胞表面CD40和CD40L表达存在正相关(r=0.648、r=0.670)。
三讨论
乙型肝炎发病机制十分复杂，目前认为宿主免疫功能紊乱是其病理损伤的主要原因[2]。而T细胞是免疫系统发挥功能的重要组成部分，其激活不仅需要外来抗原的直接刺激，而且还需要细胞间表面分子相互作用传递共刺激信号。CD40-CD40L途径是除B7/CD28途径外又一重要的共刺激途径，不只在正生理状态下参与和维持许多重要的生理功能，多种病理过程往往由这一途径的失调或紊乱而发生[3]。协同分子的低下或无能均使T细胞功能低下[4]。本文检测结果表明，慢性乙肝与肝硬化患者外周血淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L的表达百分率表达明显低于正常对照，提示HBV感染者外周血淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L低表达，这与有关文献报道相一致[5]。而HBV感染者外周血淋巴、单核细胞表面CD40、CD40L表达相关性分析表明，两者表达存在正相关。说明CD40-CD40L作为一对重要的共刺激分子在调节免疫应答过程中密切相关。
乙肝病毒的感染绝大部分是自限性，但约5-10%感染者不能最终清除病毒而发展成为慢性乙肝。在乙型肝炎病毒的清除和发病机理中，细胞免疫起着重要作用，包括特异性杀伤T细胞和CD4+辅助细胞，非特异性单核-巨噬细胞和NK细胞，其中特异性杀伤T细胞被认为是免疫应答的主要效应细胞，在病毒感染尤其是持续性病毒感染的清除中起了重要作用[6]。同时，在细胞免疫方面，已证实CD4+T细胞是调控功能中心控制器，而CD40对此有关键作用[7]。本实验说明乙肝病毒感染可能通过抑制患者DC表面的CD40等协同刺激分子的表达，从而使抗原递呈功能降低，T细胞不能有效活化为CTL,导致带有致敏原抗原靶细胞的作用减弱，不足以清除病毒，病毒能逃避免疫识别而持续存在导致肝脏的慢性病变。这与有关文献报道相一致[8]。
慢乙肝轻、中、重度及肝硬化患者外周血淋巴细胞与单核细胞表面表达CD40、CD40L无明显差异，可能是因本实验所测病例数过少或所选几组患者肝组织损伤及炎症活动改变不明显所致。慢乙肝与肝硬化患者间外周血淋巴细胞、单核细胞表面CD40、CD40L表达无显著差异，提示两组患者HBV引起肝细胞损伤的免疫机理基本相符。
本实验结果显示，HBV感染者淋巴与单核细胞表面CD40、CD40L等协同刺激分子低表达，使T细胞不能有效活化，特异性杀伤T细胞的作用减弱，不能有效清除体内病毒，导致病毒在体内持续复制，病情迁延不愈。临床上，针对性诱导或增强CD40、CD40L的表达，增强机体的细胞免疫功能，有望成为慢性乙肝治疗的新思路。
参考文献
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