本文主要研究内容
作者雷晟（2019）在《食源性病原菌多粘菌素耐药基因的耐药机制研究》一文中研究指出：近年来,随着抗生素在牲畜养殖和临床治疗中的大量使用,微生物的耐药问题逐渐受到了世界范围内食品安全和公共卫生领域的广泛关注,特别是碳青霉烯类抗生素耐药菌株的出现,直接导致了人们在面对多重耐药菌株时出现了“无药可用”的尴尬境地。在这样一种严峻的背景下,多肽类抗生素多粘菌素开始受到越来越多的关注,多粘菌素对于革兰氏阴性细菌具有杀菌和抑菌作用,特别是针对越来越频繁出现的碳青霉烯类多重耐药菌株。但是从2016年开始由质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1及其同源基因不断的被报道出来,使得多粘菌素这一防线受到严重威胁。因此,对mcr-1阳性菌株的耐药性和mcr-1及相关家族基因耐药机制的研究,对于多粘菌素耐药细菌的防控具有十分重要的意义。本论文主要从以下几个方面进行研究:mcr-1阳性耐药菌株的筛选及其耐药性分析;建立针对5个mcr家族基因的多重PCR检测方法,并且对该方法的特异性、敏感性进行验证;mcr-5基因相关工程菌株构建和其耐药机制研究。本论文的主要研究结果如下:(1)mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析。从来自巴基斯坦费萨拉巴德区养鸡场肉鸡粪便中分离出8株多粘菌素耐药菌株,经过形态学、生理生化及分子生物学鉴定,8株菌均为mcr-1阳性大肠杆菌,菌株编号分别为:PK102、PK103、PK105、PK107、PK109、PK110、PK111、PK112。8株耐药菌株的多粘菌素最小抑菌浓度(MIC)为2~8μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为4~16μg/mL。8株耐药菌株中,含mcr-1基因的质粒可分为两种类型,且均不含ISApl1插入元件。8株耐药菌株分属于ST10、ST2847、ST155、ST361、ST6395以及两个新的多位点序列分型(MLST)。耐药菌株PK105基因组测序结果显示,mcr-1基因位于一个60499 bp的IncI2型质粒上,该质粒含有一系列与接合转移有关的vir和pil家族基因。通过耐药菌株PK105的脂质A的基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析结果显示,含有一个1797.122(m/z)峰的同时,还有一个1920.136(m/z)的修饰峰。PK102、PK103、PK109、PK112、PK113菌株对12种抗生素均为耐药或中介耐药,PK105菌株对哌拉西林敏感,对其余11种抗生素为耐药或中介耐药,PK107菌株对庆大霉素敏感,对其余11种抗生素为耐药或中介耐药,PK110菌株对头孢他啶、头孢唑林敏感,对其余10种抗生素为耐药或中介耐药。(2)mcr家族基因的多重PCR检测方法的建立。针对5个mcr家族基因mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5,设计5对PCR产物长度范围在219~908 bp的特异性引物,设定相应PCR反应程序,构建针对5个mcr家族基因的多重PCR检测方法。通过以单个含mcr基因的质粒和多重混合含mcr基因的质粒为模板进行检测,验证了该检测方法的特异性和灵敏性。对156株野生型菌株进行检测,验证了该检测方法在实际运用中的有效性。同时对野生型菌株进行了关于mcr-7、mcr-8基因的检测。(3)多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药机制研究。构建有关多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药功能菌株MG1655和蛋白表达菌株BL21,以此为试验对象。经过SWISS-MODEL的生物信息预测,得到磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的12个关键氨基酸位点,构建相应位点突变菌株,通过多粘菌素最小抑菌浓度、脂质A修饰和western blot的检测,得知这12个氨基酸位点均对MCR-5的酶活作用起到重要功能。对磷酸乙醇胺转移酶MCR-1、MCR-2、MCR-5蛋白的胞外区域和跨膜区域进行预测,构建相应蛋白的胞外与跨膜互换菌株,通过对胞外与跨膜互换菌株的多粘菌素耐药功能检测。氨基酸序列相似度为81%的MCR-1与MCR-2的胞外与跨膜互换菌株仍然保留了耐药功能,而MCR-5与MCR-1/MCR-2的氨基酸序列相似度均小于35%,所以MCR-5与MCR-1/MCR-2的蛋白胞外与跨膜区域互换后,该菌株失去了耐药功能。对磷酸乙醇胺转移酶MCR-5进行体外表达纯化和酶活检测,验证了其进行磷酸乙醇胺修饰以产生耐药功能的机制。利用激光共聚焦显微镜观察和“化合物拯救”试验可知,多粘菌素可以通过刺激细菌在胞内产生活性氧以达到杀菌的目的,而耐药基因mcr-5的存在可减少多粘菌素引起的活性氧产生,从而使菌株对多粘菌素产生耐药性。此外,验证了mcr-5耐药基因表达对菌株生长的影响,比较了5个mcr家族基因的MG1655菌株的多粘菌素耐药水平高低。
Abstract
jin nian lai ,sui zhao kang sheng su zai sheng chu yang shi he lin chuang zhi liao zhong de da liang shi yong ,wei sheng wu de nai yao wen ti zhu jian shou dao le shi jie fan wei nei shi pin an quan he gong gong wei sheng ling yu de an fan guan zhu ,te bie shi tan qing mei xi lei kang sheng su nai yao jun zhu de chu xian ,zhi jie dao zhi le ren men zai mian dui duo chong nai yao jun zhu shi chu xian le “mo yao ke yong ”de gan ga jing de 。zai zhe yang yi chong yan jun de bei jing xia ,duo tai lei kang sheng su duo nian jun su kai shi shou dao yue lai yue duo de guan zhu ,duo nian jun su dui yu ge lan shi yin xing xi jun ju you sha jun he yi jun zuo yong ,te bie shi zhen dui yue lai yue pin fan chu xian de tan qing mei xi lei duo chong nai yao jun zhu 。dan shi cong 2016nian kai shi you zhi li jie dao duo nian jun su nai yao ji yin mcr-1ji ji tong yuan ji yin bu duan de bei bao dao chu lai ,shi de duo nian jun su zhe yi fang xian shou dao yan chong wei xie 。yin ci ,dui mcr-1yang xing jun zhu de nai yao xing he mcr-1ji xiang guan jia zu ji yin nai yao ji zhi de yan jiu ,dui yu duo nian jun su nai yao xi jun de fang kong ju you shi fen chong yao de yi yi 。ben lun wen zhu yao cong yi xia ji ge fang mian jin hang yan jiu :mcr-1yang xing nai yao jun zhu de shai shua ji ji nai yao xing fen xi ;jian li zhen dui 5ge mcrjia zu ji yin de duo chong PCRjian ce fang fa ,bing ju dui gai fang fa de te yi xing 、min gan xing jin hang yan zheng ;mcr-5ji yin xiang guan gong cheng jun zhu gou jian he ji nai yao ji zhi yan jiu 。ben lun wen de zhu yao yan jiu jie guo ru xia :(1)mcr-1ji yin yang xing da chang gan jun shai shua ji ji nai yao xing fen xi 。cong lai zi ba ji si tan fei sa la ba de ou yang ji chang rou ji fen bian zhong fen li chu 8zhu duo nian jun su nai yao jun zhu ,jing guo xing tai xue 、sheng li sheng hua ji fen zi sheng wu xue jian ding ,8zhu jun jun wei mcr-1yang xing da chang gan jun ,jun zhu bian hao fen bie wei :PK102、PK103、PK105、PK107、PK109、PK110、PK111、PK112。8zhu nai yao jun zhu de duo nian jun su zui xiao yi jun nong du (MIC)wei 2~8μg/mL,zui xiao sha jun nong du (MBC)wei 4~16μg/mL。8zhu nai yao jun zhu zhong ,han mcr-1ji yin de zhi li ke fen wei liang chong lei xing ,ju jun bu han ISApl1cha ru yuan jian 。8zhu nai yao jun zhu fen shu yu ST10、ST2847、ST155、ST361、ST6395yi ji liang ge xin de duo wei dian xu lie fen xing (MLST)。nai yao jun zhu PK105ji yin zu ce xu jie guo xian shi ,mcr-1ji yin wei yu yi ge 60499 bpde IncI2xing zhi li shang ,gai zhi li han you yi ji lie yu jie ge zhuai yi you guan de virhe piljia zu ji yin 。tong guo nai yao jun zhu PK105de zhi zhi Ade ji zhi fu zhu ji guang jie xi chuan lian fei hang shi jian zhi pu (MALDI-TOF MS)fen xi jie guo xian shi ,han you yi ge 1797.122(m/z)feng de tong shi ,hai you yi ge 1920.136(m/z)de xiu shi feng 。PK102、PK103、PK109、PK112、PK113jun zhu dui 12chong kang sheng su jun wei nai yao huo zhong jie nai yao ,PK105jun zhu dui pai la xi lin min gan ,dui ji yu 11chong kang sheng su wei nai yao huo zhong jie nai yao ,PK107jun zhu dui qing da mei su min gan ,dui ji yu 11chong kang sheng su wei nai yao huo zhong jie nai yao ,PK110jun zhu dui tou bao ta ding 、tou bao zuo lin min gan ,dui ji yu 10chong kang sheng su wei nai yao huo zhong jie nai yao 。(2)mcrjia zu ji yin de duo chong PCRjian ce fang fa de jian li 。zhen dui 5ge mcrjia zu ji yin mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5,she ji 5dui PCRchan wu chang du fan wei zai 219~908 bpde te yi xing yin wu ,she ding xiang ying PCRfan ying cheng xu ,gou jian zhen dui 5ge mcrjia zu ji yin de duo chong PCRjian ce fang fa 。tong guo yi chan ge han mcrji yin de zhi li he duo chong hun ge han mcrji yin de zhi li wei mo ban jin hang jian ce ,yan zheng le gai jian ce fang fa de te yi xing he ling min xing 。dui 156zhu ye sheng xing jun zhu jin hang jian ce ,yan zheng le gai jian ce fang fa zai shi ji yun yong zhong de you xiao xing 。tong shi dui ye sheng xing jun zhu jin hang le guan yu mcr-7、mcr-8ji yin de jian ce 。(3)duo nian jun su nai yao ji yin mcr-5de nai yao ji zhi yan jiu 。gou jian you guan duo nian jun su nai yao ji yin mcr-5de nai yao gong neng jun zhu MG1655he dan bai biao da jun zhu BL21,yi ci wei shi yan dui xiang 。jing guo SWISS-MODELde sheng wu xin xi yu ce ,de dao lin suan yi chun an zhuai yi mei MCR-5de 12ge guan jian an ji suan wei dian ,gou jian xiang ying wei dian tu bian jun zhu ,tong guo duo nian jun su zui xiao yi jun nong du 、zhi zhi Axiu shi he western blotde jian ce ,de zhi zhe 12ge an ji suan wei dian jun dui MCR-5de mei huo zuo yong qi dao chong yao gong neng 。dui lin suan yi chun an zhuai yi mei MCR-1、MCR-2、MCR-5dan bai de bao wai ou yu he kua mo ou yu jin hang yu ce ,gou jian xiang ying dan bai de bao wai yu kua mo hu huan jun zhu ,tong guo dui bao wai yu kua mo hu huan jun zhu de duo nian jun su nai yao gong neng jian ce 。an ji suan xu lie xiang shi du wei 81%de MCR-1yu MCR-2de bao wai yu kua mo hu huan jun zhu reng ran bao liu le nai yao gong neng ,er MCR-5yu MCR-1/MCR-2de an ji suan xu lie xiang shi du jun xiao yu 35%,suo yi MCR-5yu MCR-1/MCR-2de dan bai bao wai yu kua mo ou yu hu huan hou ,gai jun zhu shi qu le nai yao gong neng 。dui lin suan yi chun an zhuai yi mei MCR-5jin hang ti wai biao da chun hua he mei huo jian ce ,yan zheng le ji jin hang lin suan yi chun an xiu shi yi chan sheng nai yao gong neng de ji zhi 。li yong ji guang gong ju jiao xian wei jing guan cha he “hua ge wu zheng jiu ”shi yan ke zhi ,duo nian jun su ke yi tong guo ci ji xi jun zai bao nei chan sheng huo xing yang yi da dao sha jun de mu de ,er nai yao ji yin mcr-5de cun zai ke jian shao duo nian jun su yin qi de huo xing yang chan sheng ,cong er shi jun zhu dui duo nian jun su chan sheng nai yao xing 。ci wai ,yan zheng le mcr-5nai yao ji yin biao da dui jun zhu sheng chang de ying xiang ,bi jiao le 5ge mcrjia zu ji yin de MG1655jun zhu de duo nian jun su nai yao shui ping gao di 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自陕西科技大学的雷晟，发表于刊物陕西科技大学2019-07-15论文，是一篇关于大肠杆菌论文,菌株筛选论文,多粘菌素耐药基因论文,耐药机制论文,磷酸乙醇胺修饰论文,陕西科技大学2019-07-15论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自陕西科技大学2019-07-15论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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