导读:本文包含了跨损伤复制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:DNA损伤,跨损伤复制,聚合酶Y家族
跨损伤复制论文文献综述
弓毅,杨劲[1]（2013）在《DNA聚合酶Y家族在跨损伤复制中的作用》一文中研究指出普通的DNA聚合酶可以对正常的DNA完成复制,但是当DNA发生损伤,损伤位置就会成为DNA复制的阻滞点,普通的DNA聚合酶就无法完成基因组的复制。为了应对这种情况,生物体内还拥有另一类DNA聚合酶:聚合酶Y家族,又被称为跨损伤复制(TLS)聚合酶,它们的主要功能就是跨越损伤位点,完成基因组复制,解救濒死细胞。本文主要对Y家族聚合酶的结构特点、功能效应、作用机制等方面做一综述。(本文来源于《生物医学工程学杂志》期刊2013年01期）
周虎传[2]（2008）在《DNA聚合酶pol(?)及其新型剪接变异体的跨损伤复制功能的实验研究》一文中研究指出研究背景与目的细胞基因组DNA随时遭受DNA损伤的侵袭,其中引起细胞内DNA损伤的因素主要包括内源性因素和外源性因素,其中内源性因素有:复制错误;随机碱基损伤(脱氨基作用、脱嘌呤作用);代谢产物(氧自由基等因素引起的碱基氧化、甲基化、水解、错配等)。外源性因素有:化学性的(化学诱变剂碱基类似物5-BU、羟氨类(NH2OH)、亚硝酸盐(NO2)、烷化剂如氮芥类等);物理性的(紫外线、γ射线等)。面对种类繁多、数目巨大的DNA损伤,细胞拥有完善的DNA损伤应答机制,细胞会启动各种损伤修复机制或凋亡途径,使细胞DNA损伤得到修复,或使无法修复的细胞选择凋亡。如果细胞的损伤修复机制或凋亡系统失常,即DNA损伤得不到正确修复或不能凋亡,细胞基因组DNA将大量积累突变,乃至染色体畸变,导致DNA高突变型细胞的产生,最终导致癌基因的激活,原癌基因的失活,细胞由高突变表型变成肿瘤表型。针对不同的损伤机制可采用不同的损伤修复机制,如随机碱基损伤可采用碱基切除修复、碱基甲基化可采用直接修复、紫外线导致的DNA损伤可采用核苷酸切除修复等。在众多的DNA损伤修复机制中,近年来在生物细胞中发现了一种由Y家族DNA聚合酶介导的跨损伤复制机制。Y家族DNA聚合酶对DNA损伤引起的空间结构的扭曲高度耐受,能以损伤的DNA为模板进行复制,以保证DNA复制的正常进行,帮助带有损伤DNA的细胞度过难关不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依据严格的碱基互补配对原则同时缺乏缺乏3′-5′核酸外切酶活性,因此没有错配碱基的校正阅读功能,所以复制DNA时有很高的碱基错配倾向[1-3],故又称为错配倾向聚合酶。Polι属于Y家族的DNA聚合酶之一,体外研究初步阐明了PolιDNA复制保真性很低,是目前发现的保真性最低的聚合酶,其保真性较高保真聚合酶低1000-10000倍;同时主要的生物学功能为实施某些DNA损伤后的跨损伤复制。但是其体内的生物学功能尚不清楚,本课题组以前的工作发现在乳腺癌细胞中Polι过度表达,并可能参与了乳腺癌细胞中基因组高突变型的形成。同时首次发现并成功克隆了Polι的同源异构体,由于该异构体比Polι少第5个外显子,故命名为Polιs5,但Polιs5的功能尚不得知。为了进一步研究Polι及Polιs5体内的生物学功能,以及跨损伤复制在遗传不稳定性产生中的作用,我们将构建稳定高表达Polι或Polιs5的HEK-293细胞系,采用紫外线( UVC, 256nm)DNA损伤,利用激光共聚焦技术,通过对比Polι及Polιs5在UV损伤前后的细胞定位改变,观察Polι及Polιs5是否在DNA损伤后聚集到复制叉上,证实Polι及Polιs5参与体内DNA损伤后跨损伤复制过程;进一步,通过MTT法、体内突变检测系统,研究Polι及Polιs5介导的跨损伤复制的生物学功能。方法:1、HEK-293稳定高表达polι(polι-HEK-293)或polιs5(polιs5-HEK-293)细胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本实验室保存。利用氯化钙法将两个质粒分别转化入DH5α大肠杆菌,经过质粒小抽,初步鉴定后,进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT(www.genome.ucsc.edu)进行鉴定。以证明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定基础。HEK-293细胞经胰酶消化后,接种到35mm培养皿中,参照LipofectamineTM 2000脂质体操作说明,将lipofectamine2000-DNA复合物加入培养板中,37℃,5%CO2培养4小时后,换入含有血清的DMEM培养基,生长24小时后,传代致六孔板中,再培养48小时后,将培养基换为含有60Oug/ml G4l8的培养基进行稳定筛选。筛选出的抗G418的克隆经RT-PCR检测选出高表达目的基因的细胞克隆。2、Polι与Polιs5细胞定位研究。通过用激光共聚焦显微镜检测细胞在受到紫外线UVC照射后Polι及Polιs5在细胞核分布的改变分析其功能差异。培养HEK293细胞,利用阳离子脂质体瞬时转染的方法,将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别转染HEK293细胞,36小时后,用紫外线UVC(15J/m2)照射使细胞DNA损伤,4小时后用激光共聚焦显微镜观察在质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别瞬时转染的HEK293细胞,细胞内绿色荧光蛋白在紫外线照射前后分布的改变。3、Polι与Polιs5对紫外损伤耐受的功能对比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后,按8000个/孔铺板于96孔板中,第二天细胞贴壁后,将培养基吸干,用不同剂量的紫外线照射细胞,加入培养基继续培养,24小时或72小时后用MTT法检测细胞生存率。4、polι与polιs5介导U V损伤后基因突变发生的对比研究。分别用1500 J/m2,3000J/m2的紫外剂量照射pSupFG1质粒后,将其分别转染入HEK-293、polι-HEK-293和polιs5-HEK-293细胞培养48小时后;提取细胞内的supF质粒,用DpnⅠ酶切叁个小时,然后将其电转入SY204细菌;将细菌铺板在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的平板上,长出蓝白斑,数蓝白斑数量计算突变频率;挑出白斑摇菌送往上海生工公司测序,统计突变频谱。结果:1、成功将质粒pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5转化DH5α大肠杆菌,并进行质粒小抽,初步鉴定后将质粒进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT (www.genome.ucsc.edu)证明:pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定了基础。我们通过脂质体转染法成功将我们的质粒转入HEK-293细胞,通过G418筛选,最终获得抗G418抗性的细胞克隆。通过Tripure分离提取细胞总RNA,电泳结果显示:18S和28S条带显示清晰,28S条带的强度约为18S条带的2倍,5S条带极弱,未见DNA污染条带出现,表明所提取的RNA完整性好,纯度可靠,可以满足RT-PCR实验的要求。通过RT-PCR初步检测结果表明:在具有G418抗性的HEK-293细胞中,检测到Polι、Polιs5表达量增加的细胞克隆,其表达量高于未转染HEK-293细胞。2、通过质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬时转染HEK293细胞48小时后,激光共聚焦检测,结果显示质粒转染率高,在正常条件下,对照EGFP蛋白均匀分布于细胞浆与细胞核内, Polι及Polιs5则大多均匀分布于细胞核,为核蛋白。在UV (15J/m~2)照射4小时后,对照EGFP蛋白仍均匀分布于细胞浆与细胞核内;Polι及Polιs5则均出现细胞核内局部荧光聚集现象,形成复制镜像,证实Polιs5与Polι参与紫外线UVC导致的DNA损伤的跨损伤复制过程。3、用不同剂量的紫外线照射细胞后24小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到72%;稳定高表达Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到76%;稳定高表达Polιs5的Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到82%;经过统计学分析叁者之间没有明显差异。用不同剂量的紫外线照射细胞后72小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到16%; Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到12%;Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到14%;经过统计学分析叁者之间没有明显差异。4、我们将pSupFG1质粒成功转入HEK-293、polι-HEK-293、polιs5-HEK-293,并提取出细胞内PsupFG1质粒,然后高效的将其转入SY204细菌,最后铺板数出蓝白斑得出突变频率,通过挑白斑摇菌测序得出突变频谱。结果显示polι或polιs5在细胞内的过度表达将导致DNA损伤后诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。。结论:1.成功构建了稳定polι或polιs5高表达的细胞模型,为进一步研究polι和polιs5的体内生物学功能奠定基础。2.证实polι和polιs5能参与细胞紫外损伤后的细胞应答过程。3. polι和polιs5对紫外线损伤后的细胞的生存没有影响。4. polι和polιs5参与介导体内紫外线DNA损伤诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。5. polιS5作为polι的剪切异构体与polι具有相似的功能。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2008-05-01）
跨损伤复制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景与目的细胞基因组DNA随时遭受DNA损伤的侵袭,其中引起细胞内DNA损伤的因素主要包括内源性因素和外源性因素,其中内源性因素有:复制错误;随机碱基损伤(脱氨基作用、脱嘌呤作用);代谢产物(氧自由基等因素引起的碱基氧化、甲基化、水解、错配等)。外源性因素有:化学性的(化学诱变剂碱基类似物5-BU、羟氨类(NH2OH)、亚硝酸盐(NO2)、烷化剂如氮芥类等);物理性的(紫外线、γ射线等)。面对种类繁多、数目巨大的DNA损伤,细胞拥有完善的DNA损伤应答机制,细胞会启动各种损伤修复机制或凋亡途径,使细胞DNA损伤得到修复,或使无法修复的细胞选择凋亡。如果细胞的损伤修复机制或凋亡系统失常,即DNA损伤得不到正确修复或不能凋亡,细胞基因组DNA将大量积累突变,乃至染色体畸变,导致DNA高突变型细胞的产生,最终导致癌基因的激活,原癌基因的失活,细胞由高突变表型变成肿瘤表型。针对不同的损伤机制可采用不同的损伤修复机制,如随机碱基损伤可采用碱基切除修复、碱基甲基化可采用直接修复、紫外线导致的DNA损伤可采用核苷酸切除修复等。在众多的DNA损伤修复机制中,近年来在生物细胞中发现了一种由Y家族DNA聚合酶介导的跨损伤复制机制。Y家族DNA聚合酶对DNA损伤引起的空间结构的扭曲高度耐受,能以损伤的DNA为模板进行复制,以保证DNA复制的正常进行,帮助带有损伤DNA的细胞度过难关不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依据严格的碱基互补配对原则同时缺乏缺乏3′-5′核酸外切酶活性,因此没有错配碱基的校正阅读功能,所以复制DNA时有很高的碱基错配倾向[1-3],故又称为错配倾向聚合酶。Polι属于Y家族的DNA聚合酶之一,体外研究初步阐明了PolιDNA复制保真性很低,是目前发现的保真性最低的聚合酶,其保真性较高保真聚合酶低1000-10000倍;同时主要的生物学功能为实施某些DNA损伤后的跨损伤复制。但是其体内的生物学功能尚不清楚,本课题组以前的工作发现在乳腺癌细胞中Polι过度表达,并可能参与了乳腺癌细胞中基因组高突变型的形成。同时首次发现并成功克隆了Polι的同源异构体,由于该异构体比Polι少第5个外显子,故命名为Polιs5,但Polιs5的功能尚不得知。为了进一步研究Polι及Polιs5体内的生物学功能,以及跨损伤复制在遗传不稳定性产生中的作用,我们将构建稳定高表达Polι或Polιs5的HEK-293细胞系,采用紫外线( UVC, 256nm)DNA损伤,利用激光共聚焦技术,通过对比Polι及Polιs5在UV损伤前后的细胞定位改变,观察Polι及Polιs5是否在DNA损伤后聚集到复制叉上,证实Polι及Polιs5参与体内DNA损伤后跨损伤复制过程;进一步,通过MTT法、体内突变检测系统,研究Polι及Polιs5介导的跨损伤复制的生物学功能。方法:1、HEK-293稳定高表达polι(polι-HEK-293)或polιs5(polιs5-HEK-293)细胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本实验室保存。利用氯化钙法将两个质粒分别转化入DH5α大肠杆菌,经过质粒小抽,初步鉴定后,进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT(www.genome.ucsc.edu)进行鉴定。以证明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定基础。HEK-293细胞经胰酶消化后,接种到35mm培养皿中,参照LipofectamineTM 2000脂质体操作说明,将lipofectamine2000-DNA复合物加入培养板中,37℃,5%CO2培养4小时后,换入含有血清的DMEM培养基,生长24小时后,传代致六孔板中,再培养48小时后,将培养基换为含有60Oug/ml G4l8的培养基进行稳定筛选。筛选出的抗G418的克隆经RT-PCR检测选出高表达目的基因的细胞克隆。2、Polι与Polιs5细胞定位研究。通过用激光共聚焦显微镜检测细胞在受到紫外线UVC照射后Polι及Polιs5在细胞核分布的改变分析其功能差异。培养HEK293细胞,利用阳离子脂质体瞬时转染的方法,将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别转染HEK293细胞,36小时后,用紫外线UVC(15J/m2)照射使细胞DNA损伤,4小时后用激光共聚焦显微镜观察在质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别瞬时转染的HEK293细胞,细胞内绿色荧光蛋白在紫外线照射前后分布的改变。3、Polι与Polιs5对紫外损伤耐受的功能对比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后,按8000个/孔铺板于96孔板中,第二天细胞贴壁后,将培养基吸干,用不同剂量的紫外线照射细胞,加入培养基继续培养,24小时或72小时后用MTT法检测细胞生存率。4、polι与polιs5介导U V损伤后基因突变发生的对比研究。分别用1500 J/m2,3000J/m2的紫外剂量照射pSupFG1质粒后,将其分别转染入HEK-293、polι-HEK-293和polιs5-HEK-293细胞培养48小时后;提取细胞内的supF质粒,用DpnⅠ酶切叁个小时,然后将其电转入SY204细菌;将细菌铺板在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的平板上,长出蓝白斑,数蓝白斑数量计算突变频率;挑出白斑摇菌送往上海生工公司测序,统计突变频谱。结果:1、成功将质粒pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5转化DH5α大肠杆菌,并进行质粒小抽,初步鉴定后将质粒进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT (www.genome.ucsc.edu)证明:pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定了基础。我们通过脂质体转染法成功将我们的质粒转入HEK-293细胞,通过G418筛选,最终获得抗G418抗性的细胞克隆。通过Tripure分离提取细胞总RNA,电泳结果显示:18S和28S条带显示清晰,28S条带的强度约为18S条带的2倍,5S条带极弱,未见DNA污染条带出现,表明所提取的RNA完整性好,纯度可靠,可以满足RT-PCR实验的要求。通过RT-PCR初步检测结果表明:在具有G418抗性的HEK-293细胞中,检测到Polι、Polιs5表达量增加的细胞克隆,其表达量高于未转染HEK-293细胞。2、通过质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬时转染HEK293细胞48小时后,激光共聚焦检测,结果显示质粒转染率高,在正常条件下,对照EGFP蛋白均匀分布于细胞浆与细胞核内, Polι及Polιs5则大多均匀分布于细胞核,为核蛋白。在UV (15J/m~2)照射4小时后,对照EGFP蛋白仍均匀分布于细胞浆与细胞核内;Polι及Polιs5则均出现细胞核内局部荧光聚集现象,形成复制镜像,证实Polιs5与Polι参与紫外线UVC导致的DNA损伤的跨损伤复制过程。3、用不同剂量的紫外线照射细胞后24小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到72%;稳定高表达Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到76%;稳定高表达Polιs5的Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到82%;经过统计学分析叁者之间没有明显差异。用不同剂量的紫外线照射细胞后72小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到16%; Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到12%;Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到14%;经过统计学分析叁者之间没有明显差异。4、我们将pSupFG1质粒成功转入HEK-293、polι-HEK-293、polιs5-HEK-293,并提取出细胞内PsupFG1质粒,然后高效的将其转入SY204细菌,最后铺板数出蓝白斑得出突变频率,通过挑白斑摇菌测序得出突变频谱。结果显示polι或polιs5在细胞内的过度表达将导致DNA损伤后诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。。结论:1.成功构建了稳定polι或polιs5高表达的细胞模型,为进一步研究polι和polιs5的体内生物学功能奠定基础。2.证实polι和polιs5能参与细胞紫外损伤后的细胞应答过程。3. polι和polιs5对紫外线损伤后的细胞的生存没有影响。4. polι和polιs5参与介导体内紫外线DNA损伤诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。5. polιS5作为polι的剪切异构体与polι具有相似的功能。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
跨损伤复制论文参考文献
[1].弓毅,杨劲.DNA聚合酶Y家族在跨损伤复制中的作用[J].生物医学工程学杂志.2013
[2].周虎传.DNA聚合酶pol(?)及其新型剪接变异体的跨损伤复制功能的实验研究[D].第叁军医大学.2008