导读:本文包含了莨菪碱羟化酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:叁分叁,关键酶基因,莨菪碱,东莨菪碱
莨菪碱羟化酶论文文献综述
吴潇[1]（2018）在《分子改造的叁分叁莨菪碱6β-羟基化酶的功能探究》一文中研究指出天然存在的托品烷类生物碱包括樟柳碱(anisodine)、莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(6β-hydroxyhyoscyamine)、东莨菪碱(scopolamine)等。这类生物碱被广泛用于抗胆碱药,能与乙酰胆碱竞争性结合毒蕈碱受体,能阻断特定的神经脉冲,达到镇定效果,这类药主要作用于副交感神经进行治疗。叁分叁(Anisodus acutangulus)是我国云南特有的茄科多年生的药用植物,由于它可以产生较高含量的托品烷生物碱而被重视。植物代谢过程中,在莨菪碱6β-羟化酶(H6H)的作用下,经过一步羟化反应和一步环氧化反应,莨菪碱可以转化形成东莨菪碱,但在绝大多数茄科类植物中后者的量要远低于前者。而东莨菪碱因其具有药理活性高、对人体副作用小等特点,为此,在原有巨大市场基础上,东莨菪碱的需求还在迅速增长。近年来,通过基因工程手段,建立了毛状根中次生代谢产物的迅速积累培养体系,获得了一些珍贵的天然次生代谢产物,取得了令人鼓舞的研究结果,但是用基因突变改造结合转基因技术来提高次级代谢产物的研究较少。本课题在前期与华东理工大学合作筛选得到的,可在体外提高AaH6H羟化活力(突变位点Ser14Pro和Lys97Ala)的分子改造基因mAaH6H的基础上,进一步将其遗传导入叁分叁毛状根中,考察其对东莨菪碱的代谢合成与生物转化的影响。以分子改造过的mAaH6H基因为模板,克隆出该分子改造过的基因,构建含分子改造过的mAaH6H基因的植物过表达载体,并以未改造的叁分叁关键酶基因AaH6H构建植物过表达载体作对照;通过发根农杆菌介导,对叁分叁外植体进行遗传转化,从而获得分子改造过的mAaH6H基因和未改造过的AaH6H基因过表达的叁分叁转基因毛状根株系;经PCR初步检测,确定目的基因已经插入到转基因毛状根基因组中后,通过定量RT-PCR的方法分析目的基因在转基因毛状根中的表达情况,然后采用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱和东莨菪碱)的含量;分析其在叁分叁毛状根中对东莨菪碱生物合成及转化过程的影响。目前取得的结果如下:1.通过NCBI上的BLAST工具,分析找出11种不同物种的H6H同源基因,对其与AaH6H等进行系统进化树,结果表明:AaH6H与颠茄(Atropa belladonna)AbH6H的相似度最高,达到92%,其次是与(Brugmansia arborea)木本曼陀罗BaH6H的相似度达到91%。多重序列比对结果表明,叁分叁AaH6H和产托品烷生物碱物种的H6H有很高的同源性。2.将所获得的带有pMON530-AaH6H-GFP和pMON530-GFP载体的ASE农杆菌在烟草中瞬时表达。用扫描激光共聚焦显微镜进行观察,同时设立空载体对照。初步结果表明AaH6H羟化酶在细胞膜上表达。3.将AaH6H的氨基酸序列输入PDB蛋白结构数据库进行pBLAST比对,比对结果发现同源性最高的蛋白是来源于拟南芥中的花青素合酶,以该蛋白的晶体结构为模板,利用Swiss-model同源建模,分析其氨基酸突变位点,发现两个突变热点氨基酸Ser14和Lys97都位于蛋白结构的表面。4.组织表达谱分析结果表明,AaH6H为组成型表达基因,在不同组织中的表达各异,AaH6H在根中表达量最高,其次为叶,这些结果表明AaH6H主要在根中发挥功能,而大部分生物碱存在于根中。5.HPLC分析结果表明,经分子改造的mAaH6H过表达毛状根中的总生物碱含量,比AaH6H过表达毛状根中的总生物碱含量有明显的提高,其中莨菪碱、东莨菪碱的含量相比AaH6H过表达毛状根中的含量有不同程度的升高,而大部分山莨菪碱的含量相比AaH6H过表达毛状根有轻微的下降。经分子改造的mAaH6H过表达毛状根中总托品烷类生物碱含量,比AaH6H过表达毛状根中的含量有明显的提高,可能是因为分子改造的mAaH6H参与了生物碱的调控,并且分子改造后的关键酶的活性被提高了,从而促进生物碱的合成,特别是大幅度的提高了山莨菪碱向东莨菪碱的转化,对上调叁分叁毛状根东莨菪碱的含量发挥着显着的作用。(本文来源于《上海师范大学》期刊2018-05-01）
曹跃德[2]（2015）在《莨菪碱6β-羟化酶的分子改造及生物转化合成东莨菪碱的研究》一文中研究指出东莨菪碱是一种来源于茄科类植物中的抗乙酰胆碱药物,可用于阻断副交感神经,也可以作用于中枢神经系统。因为其具有药理活性高、对人体副作用小等特点,已经被应用于瞳孔放大剂、缓解痉挛药、麻醉剂以及治疗帕金森综合症和有机磷农药中毒。植物代谢过程中,在莨菪碱6β-羟化酶(H6H)的作用下,经过一步羟化反应和一步环氧化反应莨菪碱可以转化形成东莨菪碱,但在绝大多数茄科类植物中后者的量要远低于前者。本研究的目的是通过分子改造提高H6H的催化效率,利用表达H6H的重组大肠杆菌生物转化莨菪碱合成东莨菪碱。论文主要内容如下:首先,对来源于植物叁分叁(Anisodus acutanuulus)中的茛菪碱6β-羟化酶(AaH6H)进行分子改造。对AaH6H进行定向进化,结合易错PCR与定点突变发现了两个引起羟化活力提高的突变位点Ser14Pro和Lys97Glu;再利用定点饱和突变以及组合突变方法,得到了羟化活力比野生型提高0.8-3.4倍的6个突变体,其中,最好突变体S14P/K97A的羟化活力为75.4 U g-1。其次,对野生型以及突变体S14P/K97A的蛋白进行纯化以及性能表征。纯化结果显示S14P/K97A与野生型分子量大小基本一致,都为45kDa左右。S14P/K97A及野生型AaH6H均在pH 8.0的磷酸钠缓冲液以及35 ℃表现出最高活力。野生型在30℃,40℃,50℃的半衰期分别为21.6 h,4.8 h,和1.8 min,而S14P/K97A的半衰期分别是22.3 h,4.2 h,和1.7 min。Zn2+,Cu2+、Ni2+、Co2+对AaH6H活力有明显的抑制作用。酶催化底物莨菪碱的羟化反应动力学研究发现:野生型AaH6H的Km和kcat分别为41.6μM和1.0 min-1,S14P/K97A的Km和kcat分别为34.8 μM和3.9 min-1,利用生长细胞转化合成东莨菪碱,经过48h培养,突变体S14P/K97A能把100mgL-1的莨菪碱基本完全转化为东莨菪碱,而野生型只能达到25%。向培养液中加入100 mg L-1的中间产物6β-羟基莨菪碱,突变体48 h内可以将其完全转化为东莨菪碱,而野生型只有32%。最后,利用重组E.coli转化莨菪碱合成东莨菪碱。优化表达条件,确定诱导温度为16℃,诱导剂IPTG浓度为0.1 mM。在5 L发酵罐内培养表达突变体S14P/K97A的重组菌,利用生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱,发酵液中加入1.5 g莨菪碱,经过34 h培养,有97%的底物转化为东莨菪碱。从发酵液中萃取分离得到东莨菪碱1.068 g,时空产率为251 mg L-1 d-1,展示了由莨菪碱生物转化合成东莨菪碱的潜在应用价值。(本文来源于《华东理工大学》期刊2015-05-15）
刘源云[3]（2011）在《叁分叁莨菪碱6β-羟基化酶的功能鉴定》一文中研究指出莨菪碱(Hyoscyamine)，山莨菪碱（anisodine）和东莨菪碱(Scopolamine)，属于托品烷类莨菪碱，它们广泛存在于曼陀罗(Datura)、莨菪(Hyoscyamus)等茄科植物中。由于此类生物碱有较强的抗胆碱生理活性，作用于副交感神经系统，而莨菪碱和东莨菪碱作为最普遍的解痉镇痛剂和抗胆碱药物被长期广泛应用。但在药用价值上来说,东莨菪碱的药用价值是莨菪碱的10倍。而在主要生产生物碱的茄科植物中，东莨菪碱的含量相比于莨菪碱要低。所以想要获得高效用价值的东莨菪碱以满足重要临床需求是非常重要的。在野生药用植物叁分叁(Anisodusacutangulus,主要产于云南民间，历史非常久远并且已被列为国家濒危物种）中，总生物碱含量相对于其他的茄科植物来说要高，含量可达到在1％以上。在茄科植物中托品烷代谢途径中，东莨菪碱的合成是由莨菪碱-6β-羟基化酶H6H（hyoscyamine 6β-hydroxylase）催化莨菪碱经过山莨菪碱而生成东莨菪碱。而莨菪碱-6β-羟基化酶H6H属于α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶（α-oxogultaratedependent dioxygenase，2ODD)家族，它是一种双功能酶，它可以将莨菪碱的C-6位β羟基化形成山莨菪碱，然后将山莨菪碱的C-6位和C-7位环氧化形成东莨菪碱，H6H已经被证明是托品烷代谢途径中的关键酶，在植物体内起着非常重要的作用。叁分叁中托品烷代谢途径中的关键酶基因H6H的cDNA序列已经由本实验室成功获得，本课题在此基础上将H6H基因构建到原核表达载体pET30a和pGEX4T-1中，使表达的H6H蛋白和His和GST标签融合，从而形成两种不同重组的H6H蛋白（His-AaH6H和GST-AaH6H）。我们在大肠杆菌中进行H6H蛋白的原核表达，分析确认在重组蛋白的表达情况。在重组蛋白表达的情况下，根据重组蛋白的性质并对其进行蛋白纯化，用以证明蛋白是否以可溶的形式存在重组大肠杆菌中进行表达。根据重组蛋白的性质，我们选用蛋白的亲和层析法对蛋白进行纯化，顺利的得到了纯化的AaH6H的重组酶蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot分析证明该蛋白在大肠杆菌中是以活性的形式存在。此外，我们在蛋白能够以可溶的形式在大肠杆菌表达的前提下，外源添加莨菪碱到细胞培养液中，随着重组H6H蛋白的表达，莨菪碱也逐渐被转化为山莨菪碱和东莨菪碱。实验结果表明：AaH6H是一个双功能酶，既具有羟基化酶的活性（使莨菪碱转化为山莨菪），有具有环氧化的活性（山莨菪碱转化为东莨菪碱）。由此可知，通过对叁分叁托品烷代谢途径中关键基因H6H的研究，使我们明确了叁分叁中莨菪碱-6β-羟基化酶H6H体外的生化功能，有助于我们在工业生产中，有目的的生产高药用价值的东莨菪碱，从而为满足临床的需要提供了重要证据。(本文来源于《上海师范大学》期刊2011-04-01）
莨菪碱羟化酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
东莨菪碱是一种来源于茄科类植物中的抗乙酰胆碱药物,可用于阻断副交感神经,也可以作用于中枢神经系统。因为其具有药理活性高、对人体副作用小等特点,已经被应用于瞳孔放大剂、缓解痉挛药、麻醉剂以及治疗帕金森综合症和有机磷农药中毒。植物代谢过程中,在莨菪碱6β-羟化酶(H6H)的作用下,经过一步羟化反应和一步环氧化反应莨菪碱可以转化形成东莨菪碱,但在绝大多数茄科类植物中后者的量要远低于前者。本研究的目的是通过分子改造提高H6H的催化效率,利用表达H6H的重组大肠杆菌生物转化莨菪碱合成东莨菪碱。论文主要内容如下:首先,对来源于植物叁分叁(Anisodus acutanuulus)中的茛菪碱6β-羟化酶(AaH6H)进行分子改造。对AaH6H进行定向进化,结合易错PCR与定点突变发现了两个引起羟化活力提高的突变位点Ser14Pro和Lys97Glu;再利用定点饱和突变以及组合突变方法,得到了羟化活力比野生型提高0.8-3.4倍的6个突变体,其中,最好突变体S14P/K97A的羟化活力为75.4 U g-1。其次,对野生型以及突变体S14P/K97A的蛋白进行纯化以及性能表征。纯化结果显示S14P/K97A与野生型分子量大小基本一致,都为45kDa左右。S14P/K97A及野生型AaH6H均在pH 8.0的磷酸钠缓冲液以及35 ℃表现出最高活力。野生型在30℃,40℃,50℃的半衰期分别为21.6 h,4.8 h,和1.8 min,而S14P/K97A的半衰期分别是22.3 h,4.2 h,和1.7 min。Zn2+,Cu2+、Ni2+、Co2+对AaH6H活力有明显的抑制作用。酶催化底物莨菪碱的羟化反应动力学研究发现:野生型AaH6H的Km和kcat分别为41.6μM和1.0 min-1,S14P/K97A的Km和kcat分别为34.8 μM和3.9 min-1,利用生长细胞转化合成东莨菪碱,经过48h培养,突变体S14P/K97A能把100mgL-1的莨菪碱基本完全转化为东莨菪碱,而野生型只能达到25%。向培养液中加入100 mg L-1的中间产物6β-羟基莨菪碱,突变体48 h内可以将其完全转化为东莨菪碱,而野生型只有32%。最后,利用重组E.coli转化莨菪碱合成东莨菪碱。优化表达条件,确定诱导温度为16℃,诱导剂IPTG浓度为0.1 mM。在5 L发酵罐内培养表达突变体S14P/K97A的重组菌,利用生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱,发酵液中加入1.5 g莨菪碱,经过34 h培养,有97%的底物转化为东莨菪碱。从发酵液中萃取分离得到东莨菪碱1.068 g,时空产率为251 mg L-1 d-1,展示了由莨菪碱生物转化合成东莨菪碱的潜在应用价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
莨菪碱羟化酶论文参考文献
[1].吴潇.分子改造的叁分叁莨菪碱6β-羟基化酶的功能探究[D].上海师范大学.2018
[2].曹跃德.莨菪碱6β-羟化酶的分子改造及生物转化合成东莨菪碱的研究[D].华东理工大学.2015
[3].刘源云.叁分叁莨菪碱6β-羟基化酶的功能鉴定[D].上海师范大学.2011